Rotary Cell Culture System을 사용하여 시뮬레이션된 미세중력에서 림프구 배양
Summary
이것은 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 특수 일회용 배양 용기를 사용하여 시뮬레이션된 미세 중력에서 림프구를 배양하기 위한 단계별 가이드입니다. 이러한 배양 방법은 모든 현탁형 세포 배양액에 적용될 수 있다.
Abstract
우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때, 세포 배양을 지구의 모의 미세 중력 (SMG)에 적용하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 이러한 옵션은 방법, 원리 및 현탁 세포 배양에 사용하기에 적합한지 여부에 따라 다릅니다. 여기서, 세포 배양 방법은 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치라고도 하는 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 림프구를 시뮬레이션된 미세 중력에 노출시키는 방법을 설명합니다. 이 세포 배양 방법은 시간 평균 중력 벡터 무효화 원리를 활용하여 수평 축에서 세포를 회전시켜 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 이 시스템에서 배양된 세포는 세포 기능 및 생리학에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 평가하기 위해 다양한 실험 분석에서 수확 및 활용될 수 있습니다. 배양 기술은 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 약간 다를 수 있지만 여기에 설명된 방법은 모든 현탁액 유형 세포 배양에 적용될 수 있습니다.
Introduction
우주 비행은 면역 체계를 포함한 인간 생리학의 여러 측면에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 많은 연구에서 생체 내 우주 비행 및 시험관 내 모의 미세 중력 (SMG)에 대한 노출로 인한 면역 조절 장애의 증거를 입증했습니다 1,2,3,4. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 미세중력은 우주 환경5에서 낮은 중력으로 인해 경험하는 “무중력”을 의미한다. 인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다.
과학 연구를위한 실제 미세 중력 조건은 국제 우주 정거장 (ISS)의 우주 또는 궤도에 진입 한 나노 위성에서 달성 할 수 있습니다. 그러나 이러한 옵션은 오케스트레이션하는 데 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다. 우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때 지구에서 실제 미세 중력과 SMG를 유도하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 드롭 타워, 포물선 비행 및 사운딩 로켓을 포함하여 지구상에서 단기간의 실제 미세 중력을 생성할 수 있는 대규모 작업이 존재합니다. 그러나, 이들 방법들은 생물학적 시스템에 대한 미세중력의 영향을 연구하는 데 지나치게 적합하지 않은데, 이는 주로 이들의 짧은 기간의 미세중력 처리(즉, 몇 초 내지 20분)로 인한 것이다. 이러한 방법은 다른 곳에서 더 자세히 논의됩니다 5,6. 생물학적 세포 배양에 적합한 옵션에는 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치와 같은 소규모 장치와 3D 클리노스타트 또는 랜덤 포지셔닝 머신(RPM)이 포함됩니다. 이 장치는 37°C 및 5%CO2로 유지되는 세포 배양 배양기 내부에 설치할 수 있으며 수평 축(2D) 또는 두 개의 수직 축(3D)에서 세포 배양을 회전시킵니다5. 그러나 이러한 배양 방법은 생물학적 연구 맥락을 위해 우주에서 가장 실현 가능하게 달성되는 실제 미세 중력과 달리 SMG를 생성한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.
현재 논문의 목표는 2D clinostat 분류에 속하는 상업적으로 이용 가능한 RWV 장치(Table of Materials)를 사용하여 림프구를 SMG에 적용하는 단계를 설명하는 것입니다. 이 장치를 작동하기 위해 제조업체에서 사용할 수 있는 일반 프로토콜이 있지만 현재 문서에서는 문제 해결 및 최적화 단계를 더 자세히 다루는 것을 목표로 합니다. 이 기사는 또한 이 장치가 현탁 세포 배양, 특히 림프구에서 SMG를 생산하기 위해 어떻게 작동하는지에 대한 이론을 다룹니다. 이러한 맥락에서 현탁 세포 배양은 추가 스캐폴딩을 부착하지 않고 보충된 배양 배지에서 자유롭게 성장하는 세포를 말합니다. 많은 세포 유형은 림프구를 포함한 현탁 세포 배양에서 성장합니다. 림프구는 T, B, 자연살해(Natural Killer, NK) 세포를 포함한 면역계의 세포로, 림프 기관과 혈류에 존재한다7.
여기에 설명된 RWV 2D 클리노스타트는 시간-평균 중력 벡터 무효화(5,6,8,9)의 원리에 따라 동작하며, 이에 의해 중력 벡터는 수평 축 상의 세포 배양물의 회전을 통해 무작위화된다. 이것은 배양 용기의 회전 속도를 세포의 침강 속도와 일치시킴으로써 달성됩니다. 배양 용기의 회전 속도가 세포의 침강 속도와 잘 일치하는 한, 세포는 자유 낙하 상태로 유지되며 우주 환경에서 경험하는 것처럼 침전될 수 없습니다. 초기 속도 향상 단계 후, 배양 용기의 배지는 결국 시간이 지남에 따라 “고체 회전”에 도달합니다. 이러한 수평 회전은 또한 세포 배양 용기 내의 층류를 유도한다. 이것은 층류에 의해 세포에 유도된 전단 응력이 난류의 전단 응력보다 훨씬 적다는 점을 감안할 때 “낮은 전단” 환경을 만듭니다. 그러나 클리노스타트가 완벽한 시스템이 아니라는 점을 감안할 때 세포에 최소한의 전단 응력을 가하는 작은 층류 유체 운동이 도입됩니다. 따라서 미디어에 부유하는 셀은 회전 중에 이 흐름에 의해 끌립니다. 수평 회전 중에 중력 벡터는 세포에 작용하여 그림 1에 시각화된 것처럼 세포를 진동 궤적으로 만듭니다. 전단 응력의 또 다른 작은 원인은 세포가 매체를 통해 “떨어지는” 세포로 인해 세포 주위에 층류를 일으키기 때문에 발생합니다. 배양 용기가 수평축을 중심으로 회전함에 따라 세포가 경험하는 중력 벡터도 회전합니다. 시간이 지남에 따라 이 회전하는 중력 벡터는 평균적으로 0에 접근합니다. 이 현상을 시간 평균 중력 벡터 무효화라고 하며 SMG 5,6,8,9의 상태를 유도합니다. 이 장치는 많은 유형의 세포에 대한 SMG의 효과를 연구하는 데 사용되었으며, 그 중 일부는 참고 문헌10,11,12에서 다룹니다. 더 많은 예는 장치 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다.
이 RWV 장치는 장치 제조업체를 통해 사용할 수 있는 특수 “고종횡비 용기”(HARB)를 사용합니다. 이 HARV는 각각 10mL의 세포 배양을 보유합니다. 그러나 50mL HARV도 사용할 수 있습니다. 10mL 또는 50mL HARV는 다운스트림 실험 분석을 완료하는 데 필요한 세포 수에 따라 사용할 수 있으며, 이는 논의 섹션에서 자세히 설명합니다. HARV는 폴리카보네이트로 만들어졌으며 세포 배양 중에 가스 교환을 허용하기 위해 실리콘 산소화 멤브레인을 포함합니다. 이것은 세포 배지의 pH를 유지하고 효율적인 세포 호흡을 가능하게 합니다. 용기 표면에는 주 충전 포트와 두 개의 캡이 있는 주사기 포트가 있습니다(그림 2A). 주 충전 포트를 통해 세포 배양물을 적재한 후 기포 제거를 돕기 위해 두 개의 주사기를 용기에 적재합니다. 10mL 용기를 사용할 때 두 개의 3mL 주사기가 잘 작동합니다. 한 주사기는 주사기를 완전히 누른 상태에서 빈 상태로 장치에 부착되고 다른 주사기는 3mL의 세포 배양액으로 채워져 부착됩니다(그림 2E). 이들은 SMG 처리를 유지하는 데 중요한 혈관에서 기포를 제거하기 위해 조합하여 사용됩니다. 일반적으로 “플라스크” 대조군과 “1G” 대조군이라고 할 수 있는 두 개의 음성 대조군을 설정하는 것이 좋습니다. “플라스크” 대조군은 표준 T25 현탁액 세포 배양 플라스크에서 성장되는 세포에 상응한다. 1G 대조군은 특수 10mL 배양 용기에서 성장한 세포에 해당하며, 이는 단순히 인큐베이터에 배치됩니다(즉, SMG 처리를 거치지 않고). 컨트롤에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하세요.
여기에 설명된 방법은 NK92 세포주13을 사용하여 NK 세포에 특히 중점을 두고 림프구에 대한 SMG의 효과를 연구하려는 모든 연구자에게 적합합니다. 이러한 연구의 결과는 우주 비행이 인간 면역 체계에 미치는 악영향을 더 잘 이해하고 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 여기서, 시판되는 회전세포 배양 시스템을 이용하여 림프구를 SMG에 투여하는 세포 배양 방법을 설명하였다.
이 프로토콜에는 사용되는 세포 유형 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 우주국 (CSA), 연구 보조금 (17ILSRA3, Immuno Profile)의 지원을 받는다. 저자는 이 프로토콜의 초기 문제 해결에 도움을 준 Dr. Roxanne Fournier(토론토 대학교), Randal Gregg 박사(링컨 메모리얼 대학교) 및 Preteesh Mylabathula(애리조나 대학교)에게 감사를 표합니다.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
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