Dyrking av lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et roterende cellekultursystem

Summary

Dette er en trinnvis veiledning for bruk av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem for å dyrke lymfocytter i simulert mikrogravitasjon ved bruk av spesialiserte engangskulturbeholdere. Denne dyrkingsmetoden kan anvendes på enhver suspensjon-type cellekultur.

Abstract

Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det noen alternativer for å utsette cellekultur for simulert mikrogravitasjon (SMG) på jorden. Disse alternativene varierer i deres metoder, prinsipper og egnethet for bruk med suspensjonscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for simulert mikrogravitasjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem, også kjent som en 2D-klinostat eller en roterende veggbeholder (RWV) -enhet. Denne cellekulturmetoden benytter prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifisering for å simulere mikrogravitasjon ved å rotere cellene på en horisontal akse. Cellene dyrket i dette systemet kan høstes og benyttes i mange forskjellige eksperimentelle analyser for å vurdere effekten av simulert mikrogravitasjon på cellulær funksjon og fysiologi. Dyrkingsteknikken kan variere noe avhengig av celletype eller linje som brukes, men metoden beskrevet her kan brukes på enhver suspensjonstype cellekultur.

Introduction

Romfart har vist seg å påvirke mange aspekter av menneskelig fysiologi, inkludert immunsystemet. Mange studier har vist bevis på immundysregulering som følge av romfart in vivo og eksponering for simulert mikrogravitasjon (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Mikrogravitasjon refererer til “vektløsheten” som oppleves på grunn av lave gravitasjonskrefter i rommiljøet⁵. Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter.

Reelle mikrogravitasjonsforhold for vitenskapelig forskning kan oppnås i rommet ombord på Den internasjonale romstasjonen (ISS) eller i nanosatellitter lansert i bane; Imidlertid kan disse alternativene være utrolig kostbare og komplekse å orkestrere. Gitt de nåværende begrensningene ved å utføre biologisk forskning i rommet, finnes det flere alternativer for å indusere ekte mikrogravitasjon og SMG på jorden. Det finnes store operasjoner som kan produsere korte perioder med ekte mikrogravitasjon på jorden, inkludert falltårn, parabolsk flyging og lydende raketter. Imidlertid er disse metodene ikke altfor egnet for å studere effekten av mikrogravitasjon på biologiske systemer, hovedsakelig på grunn av deres korte perioder med mikrogravitasjonsbehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metodene er nærmere omtalt andre steder ^5,6. Alternativer som er egnet for biologisk cellekultur inkluderer småskala enheter som 2D klinostater eller roterende veggfartøy (RWV) enheter og 3D klinostater eller tilfeldige posisjoneringsmaskiner (RPM). Disse enhetene kan settes opp i cellekulturinkubatorer opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO₂, og de roterer cellekulturen enten på en horisontal akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D) ⁵. Det er imidlertid viktig å understreke at disse dyrkingsmetodene produserer SMG i motsetning til ekte mikrogravitasjon, som er mest mulig oppnådd i rommet for biologiske forskningssammenhenger.

Målet med det nåværende papiret er å skissere trinnene for å utsette lymfocytter til SMG ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassifiseringen. Selv om det er en generell protokoll tilgjengelig fra produsenten for bruk av denne enheten, har den nåværende artikkelen som mål å dekke feilsøkings- og optimaliseringstrinnene mer detaljert. Denne artikkelen dekker også teorien bak hvordan denne enheten fungerer for å produsere SMG i suspensjonscellekultur, spesielt med lymfocytter. I denne sammenhengen refererer suspensjonscellekultur til celler som vokser fritt i supplerte kulturmedier, uten å feste seg til ytterligere stillas. Mange celletyper dyrkes i suspensjonscellekultur, inkludert lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, inkludert T, B og Natural Killer (NK) celler, som ligger i lymfoide organer og blodet⁷.

RWV 2D-klinostaten beskrevet her opererer på prinsippet om tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon 5,6,8,9^, hvorved tyngdevektoren randomiseres gjennom rotasjon av cellekulturen på en horisontal akse. Dette oppnås ved å matche rotasjonshastigheten til kulturbeholderen til cellens sedimentasjonshastighet. Så lenge rotasjonshastigheten til kulturbeholderen er godt tilpasset cellens sedimenteringshastighet, holdes cellene i fritt fall og ute av stand til å sedimentere, slik det oppleves i rommiljøet. Etter en innledende fartsfase når mediet i kulturbeholderen til slutt “solid kroppsrotasjon” over tid. Denne horisontale rotasjonen induserer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaper et “lavskjær” miljø, gitt at skjærspenningen indusert på cellene ved laminær strømning er mye mindre enn den turbulente strømningen. Men gitt at klinostaten ikke er et perfekt system, er det noen små, laminære væskebevegelser introdusert, noe som påfører minimal skjærspenning på cellene. Som sådan blir cellene suspendert i media dratt med av denne strømmen under rotasjon. Under horisontal rotasjon virker tyngdekraftvektoren på cellene og bringer dem inn i en oscillerende bane, som visualisert i figur 1. En annen liten kilde til skjærspenning er forårsaket av at cellene “faller” gjennom mediet, forårsaker laminær strøm rundt cellene. Når kulturbeholderen roterer på en horisontal akse, roterer tyngdekraftvektoren som cellene opplever, også. Over tid er denne roterende tyngdevektoren gjennomsnittlig for å nærme seg null; dette fenomenet kalles tidsgjennomsnittlig gravitasjonsvektornullifikasjon og induserer en tilstand på SMG 5,6,8,9. Denne enheten har blitt brukt til å studere effekten av SMG på mange typer celler, hvorav noen er dekket i referanser^10,11,12. Du finner flere eksempler på enhetsprodusentens nettsted.

Denne RWV-enheten bruker spesialiserte “high aspect ratio vessels” (HARVs) tilgjengelig gjennom enhetsprodusenten. Disse HARVene holder 10 ml cellekultur hver; Imidlertid er 50 ml HARV også tilgjengelig. Enten 10 ml eller 50 ml HARV kan brukes, avhengig av hvor mange celler som trengs for å fullføre eventuelle nedstrøms eksperimentelle analyser, som er skissert nærmere i diskusjonsdelen. HARV-ene er laget av polykarbonat og inkluderer en silikonoksygeneringsmembran for å tillate gassutveksling under cellekultur. Dette opprettholder pH-verdien i cellemediet og muliggjør effektiv cellulær respirasjon. Det er en hovedfyllingsport og to kappede sprøyteporter på forsiden av fartøyet (figur 2A). Etter lasting av cellekulturen gjennom hovedfyllingsporten, lastes to sprøyter på fartøyet for å hjelpe til med boblefjerning. Ved bruk av 10 ml kar fungerer to 3 ml sprøyter godt. En sprøyte er festet til enheten tom, med sprøyten helt nedtrykt, og den andre er festet fylt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse brukes i kombinasjon for å fjerne bobler fra karet, noe som er viktig for å opprettholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det å sette opp to negative kontroller, som kan refereres til som “Kolbe” -kontrollen og “1G” -kontrollen. “Kolbe” -kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i en standard T25 suspensjonscellekulturkolbe. 1G-kontrollen tilsvarer celler som dyrkes i det spesialiserte 10 ml kulturfartøyet, som ganske enkelt plasseres i inkubatoren (dvs. uten å bli utsatt for SMG-behandlingen). Se diskusjonsdelen for mer informasjon om kontroller.

Metoden beskrevet her passer for enhver forsker som ønsker å studere effekten av SMG på lymfocytter, med et spesifikt fokus på NK-celler ved hjelp av NK92-cellelinjen¹³. Resultatene fra disse studiene kan hjelpe oss med å bedre forstå og redusere de negative effektene av romfart på det menneskelige immunsystemet.

Protocol

MERK: Følgende trinn skal fullføres inne i et sterilt biologisk sikkerhetsskap. 1. Fremstilling av fartøy for cellekultur Ta dyrkningskarene ut av plastemballasjen. Merk hvert fartøy på felgen etter hvilken celletype/linje som brukes, enten det er kontroll (1G) eller behandling (SMG), og eventuell annen relevant informasjon. Stabiliser beholderen og åpne påfyllingsporten forsiktig, uten å berøre påfyllingsportens pinne / O-ring. Plasser hetten på…

Representative Results

Denne dyrkingsmetoden anses som vellykket hvis 1) spredningen av cellene er omtrent konsistent på tvers av kontrollgruppene (og ideelt sett alle eksperimentelle grupper), 2) spredningen er hensiktsmessig gitt såtettheten, behandlingslengden og doblingstiden til celletypen / linjen, og 3) levedyktigheten til de høstede cellene er 85% eller høyere (tabell 1 ). Ideelt sett bør de resulterende cellene være så sunne som de ville være i standard cellekultur, spesielt for bruk i etterfølgende eksperime…

Discussion

Når menneskeheten forbereder seg på lengre romferder til månen og Mars, må det utføres mer forskning for å redusere alvorlige helserisiko hos astronauter. Et viktig aspekt av rommiljøet som påvirker menneskelig fysiologi er mikrogravitasjon. Her er det beskrevet en cellekulturmetode for å utsette lymfocytter for SMG ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig roterende cellekultursystem.

Denne protokollen inneholder noen kritiske trinn som kanskje må optimaliseres, avhengig av celletype…

Materials

Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL)	BD	309657	For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line	ATCC	CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 suspension culture flasks	Sarsedt	83.3910.502	For flask control