Cultivo de linfocitos en microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo celular rotativo
Summary
Esta es una guía paso a paso para usar un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente para cultivar linfocitos en microgravedad simulada utilizando recipientes de cultivo desechables especializados. Este método de cultivo se puede aplicar a cualquier cultivo celular de tipo suspensión.
Abstract
Dadas las limitaciones actuales de la realización de investigaciones biológicas en el espacio, existen algunas opciones para someter el cultivo celular a microgravedad simulada (SMG) en la Tierra. Estas opciones varían en sus métodos, principios e idoneidad para su uso con cultivo celular en suspensión. Aquí, se describe un método de cultivo celular para someter linfocitos a microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente, también conocido como clinostato 2D o dispositivo de vaso de pared giratoria (RWV). Este método de cultivo celular utiliza el principio de anulación del vector de gravedad promediado en el tiempo para simular la microgravedad girando las células sobre un eje horizontal. Las células cultivadas en este sistema se pueden cosechar y utilizar en muchos ensayos experimentales diferentes para evaluar los efectos de la microgravedad simulada en la función celular y la fisiología. La técnica de cultivo puede variar ligeramente dependiendo del tipo de célula o línea que se utilice, pero el método descrito aquí se puede aplicar a cualquier cultivo celular de tipo suspensión.
Introduction
Se ha demostrado que los vuelos espaciales afectan muchos aspectos de la fisiología humana, incluido el sistema inmunológico. Muchos estudios han demostrado evidencia de desregulación inmune como resultado de vuelos espaciales in vivo y exposición a microgravedad simulada (SMG) in vitro1,2,3,4. Un aspecto importante del entorno espacial que afecta la fisiología humana es la microgravedad. La microgravedad se refiere a la “ingravidez” experimentada debido a las bajas fuerzas gravitacionales en el entorno espacial5. A medida que la humanidad se prepara para misiones espaciales más largas a la Luna y Marte, se necesita realizar más investigación para mitigar los graves riesgos para la salud de los astronautas.
Se pueden lograr condiciones reales de microgravedad para la investigación científica en el espacio a bordo de la Estación Espacial Internacional (ISS) o en nanosatélites lanzados en órbita; Sin embargo, estas opciones pueden ser increíblemente costosas y complejas de orquestar. Dadas las limitaciones actuales de la realización de investigaciones biológicas en el espacio, existen varias opciones para inducir microgravedad real y SMG en la Tierra. Existen operaciones a gran escala que pueden producir períodos cortos de microgravedad real en la Tierra, incluidas torres de caída, vuelo parabólico y cohetes de sondeo. Sin embargo, estos métodos no son demasiado adecuados para estudiar los efectos de la microgravedad en los sistemas biológicos, en gran parte debido a sus cortos períodos de tratamiento en microgravedad (es decir, segundos a 20 minutos). Estos métodos se discuten con mayor detalle en otra parte 5,6. Las opciones que son adecuadas para el cultivo celular biológico incluyen dispositivos a pequeña escala como clinostatos 2D o dispositivos de recipiente de pared giratoria (RWV) y clinostatos 3D o máquinas de posicionamiento aleatorio (RPM). Estos dispositivos pueden instalarse dentro de incubadoras de cultivo celular mantenidas a 37 °C y 5% deCO2, y giran el cultivo celular sobre un eje horizontal (2D) o sobre dos ejes perpendiculares (3D)5. Sin embargo, es importante enfatizar que estos métodos de cultivo producen SMG en oposición a la microgravedad real, que se logra de manera más factible en el espacio para contextos de investigación biológica.
El objetivo del presente documento es describir los pasos para someter los linfocitos a SMG utilizando un dispositivo RWV (Tabla de materiales) disponible comercialmente, que cae bajo la clasificación de clinostatos 2D. Si bien existe un protocolo general disponible del fabricante para operar este dispositivo, el artículo actual tiene como objetivo cubrir los pasos de solución de problemas y optimización con más detalle. Este artículo también cubre la teoría detrás de cómo funciona este dispositivo para producir SMG en cultivo celular en suspensión, específicamente con linfocitos. En este contexto, el cultivo celular en suspensión se refiere a las células que crecen libremente en medios de cultivo suplementados, sin adherirse a ningún andamiaje adicional. Muchos tipos de células se cultivan en cultivo celular en suspensión, incluidos los linfocitos. Los linfocitos son células del sistema inmunitario, incluidas las células T, B y asesinas naturales (NK), que residen en los órganos linfoides y en el torrente sanguíneo7.
El clinostato RWV 2D descrito aquí opera según el principio de anulación del vector de gravedad promediado en el tiempo 5,6,8,9, por el cual el vector de gravedad se aleatoriza mediante la rotación del cultivo celular en un eje horizontal. Esto se logra haciendo coincidir la velocidad de rotación del recipiente de cultivo con la velocidad de sedimentación de las células. Mientras la velocidad de rotación del recipiente de cultivo se adapte bien a la velocidad de sedimentación de las células, las células se mantienen en caída libre y no pueden sedimentar, como se experimenta en el entorno espacial. Después de una fase inicial de aceleración, el medio en el recipiente de cultivo finalmente alcanza la “rotación del cuerpo sólido” con el tiempo. Esta rotación horizontal también induce el flujo laminar en el vaso de cultivo celular. Esto crea un ambiente de “bajo cizallamiento”, dado que el esfuerzo cortante inducido en las células por el flujo laminar es mucho menor que el del flujo turbulento. Sin embargo, dado que el clinostato no es un sistema perfecto, se introducen algunos pequeños movimientos de fluido laminar, que infligen un esfuerzo cortante mínimo en las células. Como tal, las células suspendidas en el medio son arrastradas por este flujo durante la rotación. Durante la rotación horizontal, el vector de gravedad actúa sobre las células y las lleva a una trayectoria oscilante, como se visualiza en la Figura 1. Otra pequeña fuente de esfuerzo cortante es causada por las células que “caen” a través de los medios, causando un flujo laminar alrededor de las células. A medida que el vaso de cultivo gira sobre un eje horizontal, el vector de gravedad experimentado por las células también gira. Con el tiempo, este vector de gravedad giratorio promedia acercarse a cero; este fenómeno se denomina anulación del vector de gravedad promediada en el tiempo e induce un estado de SMG 5,6,8,9. Este dispositivo se ha utilizado para estudiar los efectos de SMG en muchos tipos de células, algunas de las cuales están cubiertas en las referencias10,11,12. Se pueden encontrar más ejemplos en el sitio web del fabricante del dispositivo.
Este dispositivo RWV utiliza “recipientes de alta relación de aspecto” (HARV) especializados disponibles a través del fabricante del dispositivo. Estos HARV contienen 10 ml de cultivo celular cada uno; sin embargo, también hay disponibles 50 ml de HARV. Se pueden usar HARV de 10 ml o 50 ml dependiendo de cuántas células se necesiten para completar cualquier ensayo experimental posterior, que se describe más adelante en la sección de discusión. Los HARV están hechos de policarbonato e incluyen una membrana de oxigenación de silicona para permitir el intercambio de gases durante el cultivo celular. Esto mantiene el pH de los medios celulares y permite una respiración celular eficiente. Hay un puerto de llenado principal y dos puertos de jeringa tapados en la cara del recipiente (Figura 2A). Después de cargar el cultivo celular a través del puerto de llenado principal, se cargan dos jeringas en el recipiente para ayudar con la eliminación de burbujas. Cuando se usan los vasos de 10 ml, dos jeringas de 3 ml funcionan bien. Una jeringa se conecta al dispositivo vacía, con la jeringa completamente presionada, y la otra se conecta llena con 3 ml de cultivo celular (Figura 2E). Estos se utilizan en combinación para eliminar las burbujas del vaso, lo cual es importante para mantener el tratamiento SMG. En general, se recomienda configurar dos controles negativos, que pueden denominarse control “Flask” y control “1G”. El control “Flask” corresponde a las células que se cultivan en un matraz de cultivo celular en suspensión T25 estándar. El control 1G corresponde a células que se cultivan en el recipiente de cultivo especializado de 10 ml, que simplemente se coloca en la incubadora (es decir, sin ser sometido al tratamiento SMG). Consulte la sección Discusión para obtener más detalles sobre los controles.
El método descrito aquí es apropiado para cualquier investigador que busque estudiar los efectos de SMG en los linfocitos, con un enfoque específico en las células NK mediante el uso de la línea celular NK9213. Los resultados de estos estudios pueden ayudarnos a comprender mejor y mitigar los efectos adversos de los vuelos espaciales en el sistema inmunológico humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medida que la humanidad se prepara para misiones espaciales más largas a la Luna y Marte, se necesita realizar más investigación para mitigar los graves riesgos para la salud de los astronautas. Un aspecto importante del entorno espacial que afecta la fisiología humana es la microgravedad. Aquí, se ha descrito un método de cultivo celular para someter linfocitos a SMG utilizando un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente.
Este protocolo contiene algunos pasos crí…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Agencia Espacial Canadiense (CSA), beca de investigación (17ILSRA3, Immuno Profile). Roxanne Fournier (Universidad de Toronto), el Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) y Preteesh Mylabathula (Universidad de Arizona) por su ayuda con la solución de problemas iniciales de este protocolo.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
