Odling av lymfocyter i simulerad mikrogravitation med hjälp av ett roterande cellodlingssystem
Summary
Detta är en steg-för-steg-guide för att använda ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem för att odla lymfocyter i simulerad mikrogravitation med hjälp av specialiserade engångsodlingskärl. Denna odlingsmetod kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.
Abstract
Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det några alternativ för att utsätta cellodling för simulerad mikrogravitation (SMG) på jorden. Dessa alternativ varierar i sina metoder, principer och lämplighet för användning med suspensionscellodling. Här beskrivs en cellodlingsmetod för att utsätta lymfocyter för simulerad mikrogravitation med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem, även känt som en 2D-klinostat eller en roterande väggkärl (RWV) -anordning. Denna cellodlingsmetod använder principen om tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering för att simulera mikrogravity genom att rotera cellerna på en horisontell axel. Cellerna odlade i detta system kan skördas och användas i många olika experimentella analyser för att bedöma effekterna av simulerad mikrogravitation på cellulär funktion och fysiologi. Odlingstekniken kan variera något beroende på vilken celltyp eller linje som används, men den metod som beskrivs här kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.
Introduction
Rymdfärder har visat sig påverka många aspekter av mänsklig fysiologi, inklusive immunsystemet. Många studier har visat bevis på immundysregulering som ett resultat av rymdfärder in vivo och exponering för simulerad mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Mikrogravitation avser den “viktlöshet” som upplevs på grund av låga gravitationskrafter i rymdmiljön5. När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter.
Verkliga mikrogravitationsförhållanden för vetenskaplig forskning kan uppnås i rymden ombord på den internationella rymdstationen (ISS) eller i nanosatelliter som skjuts upp i omloppsbana. Dessa alternativ kan dock vara otroligt kostsamma och komplexa att orkestrera. Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det flera alternativ för att inducera verklig mikrogravitation och SMG på jorden. Storskaliga operationer finns som kan producera korta perioder av verklig mikrogravitation på jorden, inklusive dropptorn, parabolisk flygning och sondraketer. Dessa metoder är dock inte alltför lämpliga för att studera effekterna av mikrogravitation på biologiska system, till stor del på grund av deras korta perioder av mikrogravitationsbehandling (dvs. sekunder till 20 minuter). Dessa metoder diskuteras närmare på annan plats 5,6. Alternativ som är lämpliga för biologisk cellodling inkluderar småskaliga enheter såsom 2D-klinostater eller roterande väggkärl (RWV) enheter och 3D-klinostater eller slumpmässiga positioneringsmaskiner (RPM). Dessa enheter kan placeras inuti cellodlingsinkubatorer som hålls vid 37 °C och 5%CO2, och de roterar cellkulturen antingen på en horisontell axel (2D) eller på två vinkelräta axlar (3D)5. Det är dock viktigt att betona att dessa odlingsmetoder producerar SMG i motsats till verklig mikrogravitation, som mest genomförbart uppnås i rymden för biologiska forskningssammanhang.
Målet med det aktuella papperet är att beskriva stegen för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av en kommersiellt tillgänglig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassificeringen. Även om det finns ett allmänt protokoll tillgängligt från tillverkaren för att använda den här enheten, syftar den aktuella artikeln till att täcka felsöknings- och optimeringsstegen mer detaljerat. Denna artikel täcker också teorin bakom hur denna enhet fungerar för att producera SMG i suspensionscellodling, speciellt med lymfocyter. Med suspensionscellodling avses i detta sammanhang celler som växer fritt i kompletterade odlingssubstrat, utan att vidhäfta vid någon ytterligare byggnadsställning. Många celltyper odlas i suspensionscellodling, inklusive lymfocyter. Lymfocyter är celler i immunsystemet, inklusive T, B och Natural Killer (NK) celler, som finns i lymfoida organ och blodomloppet7.
RWV 2D-klinostaten som beskrivs här fungerar enligt principen om tidsmedelvärde av gravitationsvektorns nollifiering 5,6,8,9, varigenom gravitationsvektorn randomiseras genom rotation av cellkulturen på en horisontell axel. Detta uppnås genom att matcha odlingskärlets rotationshastighet med cellernas sedimenteringshastighet. Så länge odlingskärlets rotationshastighet matchas väl med cellernas sedimenteringshastighet, hålls cellerna i fritt fall och kan inte sedimentera, vilket upplevs i rymdmiljön. Efter en inledande påskyndningsfas når mediet i odlingskärlet så småningom “fast kroppsrotation” över tiden. Denna horisontella rotation inducerar också laminärt flöde i cellodlingskärlet. Detta skapar en “låg skjuvning” -miljö, med tanke på att skjuvspänningen som induceras på cellerna av laminärt flöde är mycket mindre än för turbulent flöde. Men med tanke på att klinostaten inte är ett perfekt system, finns det några små, laminära vätskerörelser införda, vilket medför minimal skjuvspänning på cellerna. Som sådan dras cellerna suspenderade i media med av detta flöde under rotation. Under horisontell rotation verkar tyngdkraftsvektorn på cellerna och för dem in i en oscillerande bana, som visualiseras i figur 1. En annan liten källa till skjuvspänning orsakas av att cellerna “faller” genom mediet, vilket orsakar laminärt flöde runt cellerna. När odlingskärlet roterar på en horisontell axel roterar också gravitationsvektorn som cellerna upplever. Med tiden närmar sig denna roterande gravitationsvektor i genomsnitt noll; detta fenomen kallas tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering och inducerar ett tillstånd av SMG 5,6,8,9. Denna enhet har använts för att studera effekterna av SMG på många typer av celler, av vilka några omfattas av referenserna10,11,12. Fler exempel finns på enhetstillverkarens webbplats.
Denna RWV-enhet använder specialiserade “högbildskärl” (HARV) som är tillgängliga via enhetstillverkaren. Dessa HARVs innehåller 10 ml cellkultur vardera; dock finns 50 ml HARVs också tillgängliga. Antingen 10 ml eller 50 ml HARV kan användas beroende på hur många celler som behövs för att slutföra eventuella nedströms experimentella analyser, vilket beskrivs vidare i diskussionsavsnittet. HARVs är gjorda av polykarbonat och inkluderar ett silikonsyresättningsmembran för att möjliggöra gasutbyte under cellodling. Detta upprätthåller pH i cellmediet och möjliggör effektiv cellulär andning. Det finns en huvudöppning och två täckta sprutportar på fartygets yta (figur 2A). Efter att cellkulturen har laddats genom huvudpåfyllningsporten laddas två sprutor på kärlet för att hjälpa till med bubbelavlägsnande. Vid användning av 10 ml kärl fungerar två 3 ml sprutor bra. En spruta är ansluten till enheten tom, med sprutan helt nedtryckt och den andra är fäst fylld med 3 ml cellkultur (figur 2E). Dessa används i kombination för att avlägsna bubblor från kärlet, vilket är viktigt för att upprätthålla SMG-behandlingen. I allmänhet rekommenderas det att ställa in två negativa kontroller, som kan kallas “Flask” -kontrollen och “1G” -kontrollen. Kolvkontrollen motsvarar celler som odlas i en standardcellodlingskolv med T25-suspension. 1G-kontrollen motsvarar celler som odlas i det specialiserade 10 ml odlingskärlet, som helt enkelt placeras i inkubatorn (dvs utan att utsättas för SMG-behandlingen). Se avsnittet Diskussion för mer information om kontroller.
Metoden som beskrivs här är lämplig för alla forskare som vill studera effekterna av SMG på lymfocyter, med ett specifikt fokus på NK-celler med hjälp av NK92-cellinjen13. Resultaten från dessa studier kan hjälpa oss att bättre förstå och mildra de negativa effekterna av rymdfärder på det mänskliga immunsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Här har en cellodlingsmetod beskrivits för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem.
Detta protokoll innehåller några kritiska steg som kan behöva optimeras beroende …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Canadian Space Agency (CSA), forskningsbidrag (17ILSRA3, Immuno Profile). Författare vill erkänna och tacka Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) och Preteesh Mylabathula (University of Arizona) för deras hjälp med den första felsökningen av detta protokoll.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
