Bir Döner Hücre Kültür Sistemi Kullanarak Simüle Edilmiş Mikrogravitede Lenfositlerin Kültürlenmesi
Summary
Bu, özel tek kullanımlık kültür kapları kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekiminde lenfositleri kültürlemek için ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanmak için adım adım bir kılavuzdur. Bu kültürleme yöntemi herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.
Abstract
Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, hücre kültürünü Dünya’daki simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz bırakmak için birkaç seçenek vardır. Bu seçenekler yöntemlerine, prensiplerine ve süspansiyon hücre kültürü ile kullanıma uygunluklarına göre değişir. Burada, lenfositleri, 2D klinostat veya dönen duvar kabı (RWV) cihazı olarak da bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi açıklanmaktadır. Bu hücre kültürü yöntemi, hücreleri yatay bir eksende döndürerek mikro yerçekimini simüle etmek için zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu prensibini kullanır. Bu sistemde kültürlenen hücreler, simüle edilmiş mikro yerçekiminin hücresel fonksiyon ve fizyoloji üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok farklı deneysel tahlilde toplanabilir ve kullanılabilir. Kültürleme tekniği, kullanılan hücre tipine veya çizgisine bağlı olarak biraz değişebilir, ancak burada açıklanan yöntem herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.
Introduction
Uzay uçuşunun, bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere insan fizyolojisinin birçok yönünü etkilediği gösterilmiştir. Birçok çalışma, in vivo uzay uçuşu ve in vitro 1,2,3,4 simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz kalmanın bir sonucu olarak immün disregülasyonun kanıtlarını göstermiştir. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Mikro yerçekimi, uzay ortamındaki düşük yerçekimi kuvvetleri nedeniyle yaşanan “ağırlıksızlığı” ifade eder5. İnsanlık Ay ve Mars’a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor.
Bilimsel araştırmalar için gerçek mikro yerçekimi koşulları, Uluslararası Uzay İstasyonu’ndaki (ISS) uzayda veya yörüngeye fırlatılan nanouydularda elde edilebilir; ancak, bu seçeneklerin düzenlenmesi inanılmaz derecede maliyetli ve karmaşık olabilir. Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, Dünya’da gerçek mikro yerçekimi ve SMG’yi indüklemek için çeşitli seçenekler mevcuttur. Düşme kuleleri, parabolik uçuş ve sondaj roketleri de dahil olmak üzere Dünya’da kısa süreli gerçek mikro yerçekimi üretebilen büyük ölçekli operasyonlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu yöntemler, büyük ölçüde kısa süreli mikro yerçekimi muamelesi (yani, saniyeler ila 20 dakika) nedeniyle, mikro yerçekiminin biyolojik sistemler üzerindeki etkilerini incelemek için aşırı derecede uygun değildir. Bu yöntemler başka yerlerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır 5,6. Biyolojik hücre kültürü için uygun olan seçenekler arasında 2D klinostatlar veya döner duvar kabı (RWV) cihazları ve 3D klinostatlar veya rastgele konumlandırma makineleri (RPM) gibi küçük ölçekli cihazlar bulunur. Bu cihazlar, 37 ° C ve% 5 CO2’de tutulan hücre kültürü inkübatörlerinin içine kurulabilir ve hücre kültürünü yatay bir eksende (2D) veya iki dikey eksende (3D)5 döndürürler. Bununla birlikte, bu kültürleme yöntemlerinin, biyolojik araştırma bağlamları için uzayda en uygun şekilde elde edilen gerçek mikro yerçekiminin aksine SMG ürettiğini vurgulamak önemlidir.
Bu makalenin amacı, 2D klinostat sınıflandırmasına giren ticari olarak temin edilebilen bir RWV cihazı (Malzeme Tablosu) kullanarak lenfositleri SMG’ye maruz bırakma adımlarını özetlemektir. Bu cihazı çalıştırmak için üreticiden genel bir protokol mevcut olsa da, mevcut makale sorun giderme ve optimizasyon adımlarını daha ayrıntılı olarak ele almayı amaçlamaktadır. Bu makale ayrıca, bu cihazın süspansiyon hücre kültüründe, özellikle lenfositlerle SMG üretmek için nasıl çalıştığının arkasındaki teoriyi de kapsamaktadır. Bu bağlamda, süspansiyon hücre kültürü, herhangi bir ek iskeleye bağlı kalmadan, takviye edilmiş kültür ortamında serbestçe büyüyen hücreleri ifade eder. Birçok hücre tipi, lenfositler de dahil olmak üzere süspansiyon hücre kültüründe yetiştirilir. Lenfositler, lenfoid organlarda ve kan dolaşımında bulunan T, B ve Doğal Öldürücü (NK) hücreleri de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücreleridir7.
Burada tarif edilen RWV 2D klinostat, zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullification 5,6,8,9 prensibi üzerinde çalışır, bu sayede yerçekimi vektörü, hücre kültürünün yatay bir eksen üzerinde dönmesiyle randomize edilir. Bu, kültür kabının dönme hızını hücrelerin çökeltme hızıyla eşleştirerek elde edilir. Kültür kabının dönme hızı, hücrelerin çökelme hızıyla iyi eşleştiği sürece, hücreler serbest düşüşte tutulur ve uzay ortamında yaşandığı gibi çökelemez. İlk hızlanma aşamasından sonra, kültür kabındaki ortam zamanla “katı vücut rotasyonuna” ulaşır. Bu yatay rotasyon aynı zamanda hücre kültürü damarında laminer akışı indükler. Bu, laminer akışla hücreler üzerinde indüklenen kayma stresinin türbülanslı akıştan çok daha az olduğu göz önüne alındığında, “düşük kesme” ortamı yaratır. Bununla birlikte, klinostatın mükemmel bir sistem olmadığı göz önüne alındığında, hücreler üzerinde minimum kayma stresi yaratan bazı küçük, laminer sıvı hareketleri vardır. Bu nedenle, medyada asılı kalan hücreler, dönme sırasında bu akış tarafından sürüklenir. Yatay dönme sırasında, yerçekimi vektörü hücrelere etki eder ve onları Şekil 1’de görselleştirildiği gibi salınımlı bir yörüngeye getirir. Bir başka küçük kayma stresi kaynağı, hücrelerin ortamdan “düşmesi” ve hücrelerin etrafında laminer akışa neden olmasından kaynaklanır. Kültür kabı yatay bir eksen üzerinde dönerken, hücrelerin deneyimlediği yerçekimi vektörü de döner. Zamanla, bu dönen yerçekimi vektörü sıfıra yaklaşmak için ortalamaya ulaşır; Bu fenomene zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu denir ve SMG 5,6,8,9 durumunu indükler. Bu cihaz, SMG’nin bazıları10,11,12 referanslarında ele alınan birçok hücre tipi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Daha fazla örnek, cihaz üreticisinin web sitesinde bulunabilir.
Bu RWV cihazı, cihaz üreticisi tarafından sunulan özel “yüksek en boy oranlı kaplar” (HARV’ler) kullanır. Bu HARR’ların her biri 10 mL hücre kültürü tutar; ancak 50 mL HARV’ler de mevcuttur. 10 mL veya 50 mL HARV’ler, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak özetlenen herhangi bir aşağı akış deneysel tahlilini tamamlamak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak kullanılabilir. HARV’ler polikarbonattan yapılmıştır ve hücre kültürü sırasında gaz değişimine izin vermek için bir silikon oksijenasyon membranı içerir. Bu, hücre ortamının pH’ını korur ve verimli hücresel solunuma izin verir. Kabın yüzünde bir ana dolum portu ve iki adet kapaklı şırınga portu bulunmaktadır (Şekil 2A). Hücre kültürünü ana dolum portundan yükledikten sonra, kabarcığın çıkarılmasına yardımcı olmak için kaba iki şırınga yüklenir. 10 mL’lik damarları kullanırken, iki adet 3 mL’lik şırınga iyi çalışır. Bir şırınga cihaza boş olarak bağlanır, şırınga tamamen bastırılır ve diğeri 3 mL hücre kültürü ile doldurulur (Şekil 2E). Bunlar, SMG tedavisini sürdürmek için önemli olan kabarcıkları damardan çıkarmak için kombinasyon halinde kullanılır. Genel olarak, “Flask” kontrolü ve “1G” kontrolü olarak adlandırılabilecek iki negatif kontrolün kurulması önerilir. “Flask” kontrolü, standart bir T25 süspansiyon hücre kültürü şişesinde yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. 1G kontrolü, inkübatöre basitçe yerleştirilen (yani, SMG işlemine tabi tutulmadan) özel 10 mL kültür kabında yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. Denetimler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
Burada açıklanan yöntem, SMG’nin lenfositler üzerindeki etkilerini incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için, NK92 hücre hattı13’ü kullanarak NK hücrelerine özel bir odaklanma ile uygundur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, uzay uçuşunun insan bağışıklık sistemi üzerindeki olumsuz etkilerini daha iyi anlamamıza ve hafifletmemize yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsanlık Ay ve Mars’a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanılarak lenfositleri SMG’ye maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi tanımlanmıştır.
Bu protokol, kullanılan hücre türüne veya satıra b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Uzay Ajansı (CSA), araştırma hibesi (17ILSRA3, İmmüno Profil) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Dr. Roxanne Fournier (Toronto Üniversitesi), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial Üniversitesi) ve Preteesh Mylabathula’ya (Arizona Üniversitesi) bu protokolün ilk sorun giderme konusundaki yardımları için teşekkür etmek ve teşekkür etmek ister.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
