Доставка экзогенной искусственно синтезированной мимической микроРНК в почку с использованием наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек
Summary
Здесь мы доставляем экзогенные искусственно синтезированные имитаторы микроРНК в почки посредством инъекции в хвостовую вену невирусного вектора и наночастиц полиэтиленимина в нескольких моделях мышей с заболеваниями почек. Это привело к значительной сверхэкспрессии мишени микроРНК в почках, что привело к ингибированию прогрессирования заболевания почек на нескольких моделях мышей.
Abstract
микроРНК (миРНК), малые некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек. Таким образом, чередование экспрессии микроРНК экзогенными искусственно синтезированными мимиками микроРНК является потенциально полезным вариантом лечения для ингибирования развития многих заболеваний почек. Однако, поскольку сывороточная РНКаза немедленно разлагает систематически вводимые экзогенные имитаторы микроРНК in vivo, доставка микроРНК в почки остается проблемой. Поэтому необходимы векторы, способные защитить экзогенные мимики микроРНК от деградации РНКазой и значительно доставить их в почку. Во многих исследованиях использовались вирусные векторы для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки. Однако вирусные векторы могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность. Таким образом, разработка вирусных векторов также является препятствием для клинического использования экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК. Чтобы преодолеть эти опасения в отношении вирусных векторов, мы разработали метод невирусного вектора для доставки имитаторов микроРНК в почку с использованием инъекции наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP) в хвостовую вену, что привело к значительной сверхэкспрессии мишенных микроРНК в нескольких мышиных моделях заболевания почек.
Introduction
микроРНК, небольшие некодирующие РНК (21-25 оснований), которые не транслируются в белки, ингибируют множество целевых матричных РНК (мРНК), дестабилизируя их и ингибируя их трансляцию при различных заболеваниях почек 1,2. Таким образом, генная терапия с использованием экзогенных искусственно синтезированных имитаторов или ингибиторов микроРНК является потенциальным новым вариантом ингибирования развития многих заболеваний почек 3,4,5.
Несмотря на перспективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для генной терапии, доставка в органы-мишени остается большим препятствием для экспериментов in vivo по развитию их клинического потенциала. Поскольку искусственно синтезированные мимики или ингибиторы микроРНК подвержены немедленной деградации сывороточной РНКазой, их период полувыведения сокращается при системном введении in vivo6. Кроме того, эффективность имитаторов или ингибиторов микроРНК для пересечения плазматической мембраны и трансфекции цитоплазмы, как правило, намного ниже без соответствующих векторов 7,8. Эти линии доказательств свидетельствуют о том, что требуется разработка системы доставки мимиков или ингибиторов микроРНК для почек, чтобы обеспечить их использование в клинических условиях и сделать их новым вариантом лечения пациентов с различными заболеваниями почек.
Вирусные векторы использовались в качестве носителей для доставки экзогенных имитаторов или ингибиторов микроРНК в почки 9,10. Несмотря на то, что они были разработаны для обеспечения биобезопасности и эффективности трансфекции, вирусные векторы все же могут вызывать интерфероновый ответ и/или генетическую нестабильность11,12. Чтобы преодолеть эти опасения, мы разработали систему доставки миРНК, имитирующую почку, с использованием наночастиц полиэтиленимина (PEI-NP), невирусного вектора, на нескольких мышиных моделях заболевания почек13,14,15.
PEI-NP представляют собой линейные НУП на основе полимеров, которые могут эффективно доставлять олигонуклеотиды, включая мимики микроРНК, в почки и считаются предпочтительными для получения невирусных векторов из-за их долгосрочной безопасности и биосовместимости13,16,17.
Это исследование демонстрирует эффекты систематической экзогенной миРНК, имитирующей доставку PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели почечного фиброза, полученной при односторонней обструкции мочеточника (UUO). Кроме того, мы демонстрируем эффекты систематической экзогенной мимической доставки микроРНК с помощью PEI-NP посредством инъекции в хвостовую вену у мышей модели диабетической болезни почек (мышей db / db: C57BLKS / J Iar – + Lepr db / + Leprdb) и модельных мышей с острым повреждением почек, вызванных ишемией-реперфузионным повреждением почек (IRI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя протокол, представленный в этой рукописи, PEI-NP могут доставлять мимики микроРНК в почку, чтобы индуцировать сверхэкспрессию мишенных микроРНК, что приводит к лечебным эффектам на мышиных моделях in vivo нескольких заболеваний почек, включая фиброз почек, диабетическую боле…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI (грант No 21K08233). Мы благодарим Edanz (https://jp.edanz.com/ac) за редактирование черновиков этой рукописи.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
