Her leverer vi eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger til nyrene via haleveneinjeksjon av en ikke-viral vektor og polyetylenimin nanopartikler i flere musemodeller for nyresykdom. Dette førte til betydelig overekspresjon av mål-miRNA i nyrene, noe som resulterte i hemmet progresjon av nyresykdom i flere musemodeller.
mikroRNA (miRNA), små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer. Derfor er veksling av miRNA-ekspresjon ved eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger et potensielt nyttig behandlingsalternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer. Men fordi serum RNAase umiddelbart nedbryter systematisk administrerte eksogene miRNA-etterligninger in vivo, er levering av miRNA til nyrene fortsatt en utfordring. Derfor er vektorer som kan beskytte eksogene miRNA-etterligninger fra nedbrytning av RNAase og levere dem betydelig til nyrene, nødvendige. Mange studier har brukt virale vektorer for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene. Imidlertid kan virale vektorer forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet. Derfor er utviklingen av virale vektorer også et hinder for klinisk bruk av eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere. For å overvinne disse bekymringene angående virale vektorer, utviklet vi en ikke-viral vektormetode for å levere miRNA-etterligninger til nyrene ved hjelp av haleveneinjeksjon av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), noe som førte til betydelig overekspresjon av målmiRNA i flere musemodeller av nyresykdom.
miRNAer, små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere dem og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer 1,2. Derfor er genterapi som bruker eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere et potensielt nytt alternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer 3,4,5.
Til tross for løftet om miRNA-etterligninger eller hemmere for genterapi, er levering til målorganer fortsatt et stort hinder for in vivo-eksperimenter for å utvikle sitt kliniske potensial. Fordi kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere er gjenstand for umiddelbar nedbrytning av serum-RNase, forkortes halveringstiden ved systemisk administrering in vivo6. I tillegg er effektiviteten til miRNA-etterligninger eller hemmere for å krysse plasmamembranen og transfekt cytoplasma generelt mye lavere uten passende vektorer 7,8. Disse bevisene tyder på at utviklingen av miRNA-etterlignings- eller inhibitorleveringssystemet for nyrene er nødvendig, for å muliggjøre bruk i kliniske omgivelser og gjøre dem til et nytt behandlingsalternativ for pasienter med ulike nyresykdommer.
Virale vektorer har blitt brukt som bærere for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene 9,10. Selv om de er utviklet for biosikkerhet og transfeksjonseffekt, kan virale vektorer fortsatt forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet11,12. For å overvinne disse bekymringene utviklet vi et miRNA-etterligningssystem for nyrene ved hjelp av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), en ikke-viral vektor, i flere musemodeller av nyresykdom13,14,15.
PEI-NP er lineære polymerbaserte NPer som effektivt kan levere oligonukleotider, inkludert miRNA-etterligninger, til nyrene, og anses å foretrekke for fremstilling av ikke-virale vektorer på grunn av deres langsiktige sikkerhet og biokompatibilitet13,16,17.
Denne studien demonstrerer effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i nyrefibrosemodellmus produsert ved ensidig ureterobstruksjon (UUO). I tillegg demonstrerer vi effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i diabetisk nyresykdomsmodellmus (db / db mus: C57BLKS / J Iar – + Lepr db / + Leprdb) og akutt nyreskade modell mus produsert av renal iskemi-reperfusjonsskade (IRI).
Ved hjelp av protokollen som presenteres i dette manuskriptet, kan PEI-NP levere miRNA-etterligninger til nyrene for å indusere overekspresjon av mål-miRNA, noe som resulterer i behandlingseffekter i in vivo musemodeller av flere nyresykdommer, inkludert nyrefibrose, diabetisk nyresykdom og AKI.
Metoden for å forberede komplekset av PEI-NP og miRNA-etterligning er veldig enkel. Den positivt ladede overflaten av PEI-NP fanger miRNA-etterligningen når de bare blandes 13,14,15,16,17<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Vi takker Edanz (https://jp.edanz.com/ac) for redigering av utkast til dette manuskriptet.
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |