בידוד ופרופיל של תאי אנדותל עורקים מזנטריים ראשוניים אנושיים ברמת השעתוק
Summary
הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבית והפרופיל של תאי האנדותל מהעורק המזנטרי האנושי. בנוסף, מסופקת שיטה להכנת העורק האנושי לתעתיק מרחבי. פרוטאומיקה, תעתיק ובדיקות תפקודיות יכולות להתבצע על תאים מבודדים. פרוטוקול זה יכול להיות repurposed עבור כל עורק בגודל בינוני או גדול.
Abstract
תאי אנדותל (ECs) חיוניים לתפקוד כלי הדם והגוף כולו באמצעות התגובה הדינמית שלהם לרמזים סביבתיים. הבהרת השעתוק והאפיגנום של ECs היא בעלת חשיבות עליונה להבנת תפקידם בהתפתחות, בבריאות ובמחלות, אך היא מוגבלת בזמינותם של תאים ראשוניים מבודדים. הטכנולוגיות האחרונות אפשרו פרופיל בתפוקה גבוהה של תעתיק EC ואפיגנום, מה שהוביל לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי EC שלא היו ידועים קודם לכן ומסלולי התפתחות. בעוד שתרביות EC הן כלי שימושי בחקר תפקוד EC וחוסר תפקוד לקוי, תנאי התרבית והקטעים המרובים יכולים להציג משתנים חיצוניים המשנים את התכונות של EC ילידי, כולל מורפולוגיה, מצב אפיגנטי ותוכנית ביטוי גנים. כדי להתגבר על מגבלה זו, המאמר הנוכחי מדגים שיטה לבידוד ECs ראשוניים אנושיים מעורקים מזנטריים של תורמים שמטרתם ללכוד את מצב מולדתם. ECs בשכבה האינטימית מנותקים מכנית וביוכימית עם שימוש באנזימים מסוימים. התאים המתקבלים יכולים לשמש ישירות לריצוף RNA בתפזורת או לריצוף RNA חד-תאי או מצופה לתרבית. בנוסף, מתוארת זרימת עבודה להכנת רקמת עורקים אנושית עבור תעתיק מרחבי, במיוחד עבור פלטפורמה זמינה מסחרית, אם כי שיטה זו מתאימה גם לטכניקות אחרות של פרופיל תעתיק מרחבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו על כלי שיט שונים שנאספו ממגוון תורמים במצבי בריאות או מחלות כדי לקבל תובנות לגבי ויסות שעתוק ואפיגנטי של EC, היבט מרכזי בביולוגיה של תאי האנדותל.
Introduction
תאי האנדותל (ECs) הם מווסתים חיוניים של טונוס כלי הדם ושל זלוף הרקמות. ECs הם יוצאי דופן ביכולתם להגיב לסביבה החוץ-תאית ולהסתגל לשינויים בדינמיקה ובהרכב של זרימת הדם. תגובות דינמיות אלה מתווכות באמצעות רשת של אירועי איתות תוך-תאיים, כולל אפנון שעתוק ופוסט-שעתוק עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית. חוסר הוויסות של תגובות אלה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל אך לא מוגבל למחלות לב וכלי דם, סוכרת וסרטן 1,2.
חלק גדול מהמחקרים עושים שימוש בקווי תאים או במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את תעתיק ה-EC. הראשון הוא כלי שימושי, בהתחשב בקלות השימוש היחסית ובזולות. עם זאת, התרבות הסדרתית יכולה להכניס שינויים פנוטיפיים ל-ECs, כגון תכונות פיברובלסטיות וחוסר קיטוב, ולנתק אותן ממצב ה-in vivo 3 שלהן. התאים הראשוניים, למשל, EC של וריד טבור אנושי (HUVEC) היו בחירה פופולרית מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, אך הם נגזרים ממצע כלי דם התפתחותי שאינו קיים אצל מבוגרים, ולכן לא סביר שייצגו באופן מלא ECs בוגרים. בעלי חיים, במיוחד מודלים של עכברים, מייצגים טוב יותר את הסביבה הפיזיולוגית או הפתופיזיולוגית של ECs ומאפשרים חקירה של תעתיקים כתוצאה מהפרעה גנטית. ניתן לבודד את ה-ECs של מורין מרקמות שונות, כולל אבי העורקים, הריאות ורקמות השומן באמצעות הליכים מבוססי אנזימים 4,5,6,7. עם זאת, לא ניתן להשתמש בתאים המבודדים עבור מעברים מרובים אלא אם כן הם מומרים6 ולעתים קרובות הם מוגבלים במספרם, מה שדורש איגום מבעלי חיים מרובים 5,8,9.
הופעתן של טכנולוגיות חדשות החוקרות את ארכיטקטורת כלי השיט ברמה תעתיקית, במיוחד עם רזולוציה של תא יחיד, אפשרה עידן חדש של ביולוגיה אנדותל על ידי חשיפת פונקציות ותכונות חדשניות של ECs 5,10,11,12,13,14. משאב עשיר שנבנה על ידי חוקרי טאבולה מוריס אסף פרופילי תעתיק חד-תאיים של 100,000 תאים, כולל ECs על פני 20 איברי מורין שונים15, אשר חשפו הן גנים נפוצים של סמן EC והן חתימות תעתיק ייחודיות עם הבדלים בין רקמותותוך-רקמה 5,13. עם זאת, ישנם הבדלים ברורים בין עכבר לאדם בגנום, באפיגנום ובשעתוק, במיוחד באזורים שאינם מקודדים 16,17,18. חסרונות אלה הנ”ל מדגישים את החשיבות של ניתוח של ECs באמצעות דגימות אנושיות על מנת לקבל פרופיל נאמן של ECs במדינת מולדתם בבריאות ומחלות.
רוב שיטות הבידוד של EC מסתמכות על דיסוציאציה פיזית באמצעות הומוגניזציה, חיתוך דק וטחינה של הרקמה לפני הדגירה עם אנזימים פרוטאוליטיים לזמנים שונים. האנזימים והתנאים גם משתנים במידה ניכרת בין סוגי הרקמות, מטריפסין ועד קולגן, המשמשים לבדם או בשילוב 19,20,21. העשרה או טיהור נוספים מבוססי נוגדנים נכללים לעתים קרובות כדי להגביר את טוהר ה- ECs. בדרך כלל, נוגדנים נגד סמני ממברנה EC, למשל, CD144 ו- CD31 מצומדים לחרוזים מגנטיים ומוסיפים לתרחיף התא22,23. אסטרטגיה כזו יכולה להיות מותאמת באופן כללי לבידוד EC ממספר רקמות אנושיות ועכבריות, כולל הטכניקות שהוצגו בפרוטוקול זה.
במצבם המקורי, ECs מקיימים אינטראקציה עם סוגי תאים מרובים ועשויים להתקיים בנישות כלי דם שבהן קרבת התאים חיונית לתפקוד. בעוד שמחקרים של ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני (scRNA ו-snRNA-seq) היו בעלי חשיבות עליונה לפריצות הדרך האחרונות בתיאור ההטרוגניות של EC, תהליך הדיסוציאציה משבש את הקשר הרקמות ואת המגע בין התא לתא, שגם הם חשובים להבנת הביולוגיה של EC. פותח בשנת 2012 ונבחר לשיטת השנה בשנת 202024, פרופיל תעתיק מרחבי שימש לפרופיל ביטוי גנים גלובלי תוך שמירה על המאפיינים המרחביים ברקמות שונות כולל מוח25, גידול26 ורקמת שומן27. ניתן למקד את הטכנולוגיות, תוך שימוש בגששים מיוחדים ספציפיים לרצפי RNA מסוימים המחוברים לריאגנטים של זיקה או לתגים פלואורסצנטיים, ובכך לזהות גנים נבחרים ברזולוציה תת-תאית 28,29,30,31. הם יכולים גם להיות לא ממוקדים32,33, בדרך כלל באמצעות אוליגונוקלאוטידים בעלי ברקוד מרחבי כדי ללכוד רנ”א, אשר יחד מומרים ל-cDNA להכנת ספריית seq לאחר מכן ולכן יש להם את היתרון של הסקת ביטוי גנים של רקמות שלמות באופן בלתי משוחד. עם זאת, רזולוציה מרחבית אינה מושגת כיום ברמה תאית אחת עם טכנולוגיות זמינות מסחרית. ניתן להתגבר על כך במידה מסוימת באמצעות שילוב נתונים עם נתוני scRNA-seq, מה שבסופו של דבר מאפשר מיפוי של תעתיק חד-תאי בהקשר של רקמה מורכבת תוך שמירה על המידע המרחבי המקורי שלו34.
כאן, מתוארת זרימת עבודה לפרופיל תעתיק EC באמצעות עורק מזנטרי עליון אנושי, עורק היקפי ששימש לחקר הרחבת כלי דם, שיפוץ כלי דם, עקה חמצונית ודלקת 35,36,37. שתי טכניקות מתוארות: 1) לבודד ולהעשיר ECs מן האינטימה של כלי הדם המשלבים דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי המתאים לריצוף תעתיק של תאים בודדים או לתרבית מבחנה שלאחר מכן; 2) להכין מקטעי עורקים ליצירת פרופיל תעתיק מרחבי (איור 1). ניתן לבצע את שתי הטכניקות הללו באופן עצמאי או משלים לפרופיל ECs ולתאים הסובבים אותם. יתר על כן, ניתן להתאים זרימת עבודה זו לשימוש בכל עורק בינוני או גדול.
Protocol
Representative Results
Discussion
זרימת העבודה המוצגת מפרטת סדרה של טכניקות ליצירת פרופיל של ECs מתוך פיסת עורק אנושי יחידה עם רזולוציה חד-תאית ומרחבית. ישנם מספר שלבים קריטיים וגורמים מגבילים בפרוטוקול. אחד המפתחות ליצירת פרופילי תעתיק הוא רעננות הרקמה ותקינות הרנ”א. חשוב לשמור על רקמות על קרח ככל האפשר לפני העיבוד כדי למז…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (ל- Z.B.C.); DP1DK126138 ו- DP1HD087990 (ל- S.Z.); מענק של קרן אלה פיצג’רלד ופרויקט משפחת וונק (ל-Z.B.C.); ומענק רשת זרעים של אטלס תאים אנושיים (ל-Z.B.C. ול-S.Z.). המחקר שדווח בפרסום זה כלל עבודה שבוצעה בליבת הגנומיקה האינטגרטיבית בעיר התקווה הנתמכת על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA033572. המחברים רוצים להודות לד”ר איסמעיל אל-עבדאללה ולד”ר מריגנג צ’י מצוות השתלת האיים ב-City of Hope לבידוד רקמות אנושיות, לד”ר דונגצ’יאנג יואן ב-City of Hope על עזרתו בניתוח scRNA-seq, ולד”ר מארק הלושקה מהמחלקה לפתולוגיה של הלב וכלי הדם, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’ונס הופקינס על תובנותיו שלא יסולאו בפז על היסטולוגיה של כלי הדם.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).
