트리파노소마 크루지 또는 기타 병원성 유기체의 DNA 검출을 위한 즉시 사용 가능한 qPCR
Summary
본 연구는 반응 용기에 미리 로드되어 몇 달 동안 냉장고에 보관할 수 있는 T. cruzi DNA 검출을 위해 즉시 사용 가능한 qPCR을 생산하는 단계를 설명합니다.
Abstract
Real-time PCR(qPCR)은 다수의 샘플에서 미량의 핵산 표적을 증폭할 수 있는 매우 민감하고 정밀한 기술입니다. 그것은 많은 연구 분야에서 광범위하게 사용되어 왔으며 유전자 변형 유기체 (GMO) 작물의 작물에서 인간 진단 및 형질 선택과 같은 분야에서 산업적 응용을 달성했습니다. 그러나 qPCR은 오류 방지 기술이 아닙니다. 모든 시약을 단일 마스터 혼합물로 혼합한 후 일반 qPCR 플레이트의 96개 웰에 분배하면 시약의 잘못된 혼합 또는 웰로의 부정확한 분주와 같은 작업자 실수가 발생할 수 있습니다. 여기에서는 겔화라고 불리는 기술이 제시되며, 마스터 믹스에 존재하는 대부분의 물은 진공 상태로 제출 될 때 졸-겔 혼합물을 형성하는 시약으로 대체됩니다. 결과적으로, qPCR 시약은 실온에서 몇 주 동안 또는 2-8 oC에서 몇 달 동안 효과적으로 보존됩니다. 각 용액 준비에 대한 세부 사항은 T. cruzi 위성 DNA (satDNA)를 검출하도록 설계된 겔화 반응의 예상 측면과 함께 여기에 나와 있습니다. 유사한 절차를 적용하여 다른 유기체를 검출 할 수 있습니다. 겔화된 qPCR 실행을 시작하는 것은 냉장고에서 플레이트를 제거하고, 샘플을 각각의 웰에 추가하고, 실행을 시작하는 것만큼 간단하므로 전체 플레이트 반응의 설정 시간을 샘플을 로드하는 데 걸리는 시간으로 줄일 수 있습니다. 또한 겔화 PCR 반응을 생산하고 품질을 위해 배치로 제어할 수 있어 시간을 절약하고 일상적인 PCR 반응을 실행하는 동안 일반적인 작업자 실수를 방지할 수 있습니다.
Introduction
샤가스병은 20세기 초 빈곤이 만연한 브라질의 시골 지역에서 발견되었습니다.1,2. 오늘날에도이 질병은 아메리카 대륙의 건강의 사회적, 경제적 결정 요인과 계속 연결되어 있습니다. 샤가스병은 급성기 및 만성기를 포함하는 이상성이다. Trypanosoma cruzi 기생충에 의한 감염, 곤충 매개체에 의해 전염, 선천적 경로를 통한 수혈 또는 오염 된 음식 3,4의 경구 섭취로 인해 발생합니다.
샤가스병의 진단은 임상 증상(특히 로마냐 징후), 혈액 도말 현미경, 혈청학 및 실시간 PCR(qPCR) 또는 등온 증폭 4,5,6,7,8,9와 같은 분자 검사의 관찰을 통해 이루어질 수 있습니다. 임상 증상 및 혈액 도말 현미경 검사는 급성 감염이 의심되는 경우에 사용되는 반면 항체 검색은 무증상 환자의 선별 도구로 사용됩니다. qPCR은 민감도와 특이성으로 인해 만성 환자, 혈액 내 기생충 부하를 측정하는 치료를 받는 급성 환자의 모니터링 도구 및 치료 실패의 대리 마커로 사용되는 것으로 제안되었습니다.6,8,10,11,12 . 현재 이용 가능한 검사보다 더 민감하고 구체적이지만, qPCR은 운송 및 보관을 위한 동결 온도 요구 사항으로 인해 전 세계적으로 소외된 지역에서 진단 도구로 알려지는 것을 효과적으로 방지합니다13,14,15.
이 장애물을 피하기 위해 동결 건조 및 겔화와 같은 보존 기술이 탐구되었습니다16,17. 동결 건조는 수년간 보존을 제공하지만 효소 안정화 / 보존에 일반적으로 사용되는 글리세롤이없는 특수 제작 된 시약이 필요합니다18. 겔화는 수개월 동안 보존을 제공하는 것으로 나타났지만, 이는 규칙적인 시약(19)의 사용을 허용한다. 겔화 용액은 공정에서 각각 특정 역할을 하는 4가지 구성 요소로 구성됩니다: 당 트레할로스 및 멜레지토스는 용액의 자유 물 분자를 감소시켜 건조 과정에서 생체 분자를 보호하고, 글리코겐은 더 넓은 보호 매트릭스를 생성하며, 아미노산 라이신은 생체 분자의 카르복실 사이의 산화 반응을 억제하는 자유 라디칼 제거제로 사용되며, 아미노 및 인산염 그룹. 이들 성분은 건조 과정 동안 3차 또는 4차 구조의 손실을 방지하는 졸-겔 혼합물을 정의하여, 재수화 시 생체분자의 활성을 유지하는 것을 돕는다(19). 일단 반응 튜브 내부에서 안정화되면, 반응은 일반 -20 °C 대신 2-8 °C에서 몇 달 동안 또는 21-23 °C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다. 이 접근법은 이미 샤 가스 병, 말라리아, 리 슈만 편모충 증, 결핵 및 시클로 스포리아증 13,14,15,20과 같은 질병을 진단하는 데 도움이되도록 설계된 테스트에 통합되었습니다.
본 작업은 겔화 절차에 필요한 솔루션을 준비하는 모든 단계, 공정의 함정 및 8-튜브 스트립 내에서 즉시 사용 가능한 겔화된 qPCR의 예상되는 최종 측면을 설명합니다. 동일한 프로토콜을 단일 튜브 또는 96웰 플레이트에 적용할 수 있습니다. 마지막으로, T. cruzi DNA의 검출은 대조군 실행으로 표시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 몇 년 동안 열대성 및 방치 된 질병을 진단하는 데 도움이되는보다 민감하고 구체적인 기술을 찾아야 할 필요성이 강조되었습니다. 역학 통제에 중요하지만 기생충 검사(광학 현미경) 및 혈청 검사는 특히 민감도 및 현장 진료 적용 가능성과 관련하여 한계가 있습니다. PCR, 등온 증폭 및 각각의 변형과 같은 DNA 증폭 기술은 실험실 환경에서 오랫동안 사용되어 왔지만 기술적 장애물로 인해 현…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 진공 오븐에 대한 기술 지원에 대해 Aline Burda Farias와 해당 장비에 대한 액세스를 허용한 Instituto de Biologia Molecular do Parana(브라질 쿠리티바, IBMP)의 행정부에 감사를 표하고 싶습니다. 이 작업은 CNPq 445954/2020-5 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
