Mesure des propriétés du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de la microscopie à éclairage structuré en 3D (3D-SIM)
Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour visualiser et mesurer les anneaux d’actine et d’autres composants du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de neurones hippocampiques de rat cultivés et d’une microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM).
Abstract
Le segment initial axonal (AIS) est le site où les potentiels d’action s’initient et constitue un filtre de transport et une barrière de diffusion qui contribuent au maintien de la polarité neuronale en triant les cargaisons somato-dendritiques. Un squelette périodique membranaire (MPS) comprenant des anneaux d’actine périodiques fournit un échafaudage pour ancrer diverses protéines AIS, y compris des protéines structurelles et différents canaux ioniques. Bien que les approches protéomiques récentes aient permis d’identifier un nombre considérable de nouveaux composants de l’AIS, les détails de la structure du MPS et les rôles de ses composants individuels font défaut. La distance entre les anneaux d’actine individuels dans le MPS (~ 190 nm) nécessite l’utilisation de techniques de microscopie à super-résolution pour résoudre les détails structurels du MPS. Ce protocole décrit une méthode d’utilisation de neurones hippocampiques de rat cultivés pour examiner la localisation précise d’une protéine AIS dans le MPS par rapport aux anneaux d’actine sous-membraneux à l’aide de la microscopie à éclairage structuré en 3D (3D-SIM). En outre, une approche analytique pour évaluer quantitativement la périodicité des composants individuels et leur position par rapport aux anneaux d’actine est également décrite.
Introduction
Le segment initial de l’axone (AIS) est une région courte et spécialisée de l’axone proximal des neurones vertébrés1. L’AIS comprend un filtre de transport et une barrière de diffusion essentiels au maintien de la polarité neuronale par le tri des cargaisons somato-dendritiques2,3,4,5,6,7. De plus, la structure unique de l’AIS lui permet d’accueillir des grappes de canaux ioniques voltage-dépendants qui facilitent sa fonction de site d’initiation du potentiel d’action8. Un complexe structurel très stable sous-tend les fonctions uniques de l’AIS. La recherche au cours de la dernière décennie a révélé la présence d’un squelette périodique membranaire (MPS) contenant des anneaux d’actine reliés par la spectrine et fournissant un échafaudage pour ancrer diverses protéines AIS9,10.
La distance entre les anneaux d’actine dans le MPS (~190 nm)9,10 est inférieure à la limite de résolution de la microscopie optique conventionnelle. Les premières tentatives d’utilisation de la microscopie électronique pour visualiser le MPS n’ont pas abouti, car les procédures de préparation difficiles impliquées n’ont pas réussi à préserver la structure du MPS. Ainsi, les techniques de microscopie à super-résolution se sont avérées inestimables pour élucider certains des détails structurels du MPS11. Cependant, la compréhension du complexe structurel de l’AIS, l’identité et les fonctions de ses composants, ainsi que sa régulation spatio-temporelle sont encore incomplètes. Des études protéomiques récentes ont réussi à créer une liste importante de protéines qui se localisent dans l’AIS à proximité des composants structurels de l’AIS12,13. Pourtant, les détails de leur fonction et leur place précise dans le complexe AIS manquent. Ainsi, les techniques de microscopie à super-résolution servent d’outil essentiel pour examiner les positions précises de ces protéines par rapport aux autres composants MPS et étudier leurs fonctions. Plusieurs techniques de microscopie optique peuvent atteindre des résolutions supérieures à la limite de diffraction de la lumière, certaines pouvant même localiser des molécules uniques. Cependant, bon nombre de ces techniques nécessitent généralement des fluorophores spécialisés ou des tampons d’imagerie, et l’acquisition d’images prend souvent beaucoup de temps14.
La microscopie à éclairage structuré 3D (3D-SIM), en raison de sa facilité d’utilisation et de ses exigences simples en matière de préparation des échantillons, ne nécessite aucun réactif spécial pour l’imagerie ou la préparation des échantillons, fonctionne bien avec un large éventail de fluorophores et d’échantillons, peut être facilement mise en œuvre en plusieurs couleurs et est capable d’imagerie sur cellules vivantes15. Bien que la meilleure résolution possible offerte par la carte SIM (~ 120 nm) soit faible par rapport à de nombreuses autres techniques de super-résolution, elle est suffisante pour de nombreuses applications (par exemple, pour résoudre les composants du MPS dans les neurones). Ainsi, il est crucial de considérer l’exigence d’applications spécifiques pour déterminer si la carte SIM est un choix approprié ou si une résolution encore plus élevée est nécessaire. Ici, un protocole est décrit pour l’utilisation de neurones hippocampiques cultivés et de microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM) pour examiner la position et l’organisation des protéines AIS putatives par rapport aux anneaux d’actine dans le MPS, comme mis en œuvre dans Abouelezz et al.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode pour visualiser et mesurer les protéines MPS en utilisant la technique de super-résolution. Comme les anneaux d’actine et d’autres composants MPS affichent une périodicité d’environ 190 nm9,10, les approches d’imagerie conventionnelles à diffraction limitée ne peuvent pas révéler les détails du MPS. Plusieurs configurations de microscopie peuvent résoudre des structures limitées par diffraction en s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Dre Pirta Hotulainen est reconnue pour ses commentaires critiques, d’une valeur inestimable pour la préparation de ce manuscrit. La Dre Rimante Minkeviciene est reconnue pour son aide dans la préparation des cultures neuronales utilisées pour les expériences originales. Toute l’imagerie a été réalisée dans l’unité d’imagerie Biomedicum. Ce travail a été soutenu par l’Académie de Finlande (D.M., SA 266351) et le programme doctoral Brain & Mind (A.A.)
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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