Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter rotter med overfladeglomeruli for at kvantificere virkningerne af langvarig ureteral obstruktion på glomerulær dynamik og funktion.
Anvendelse af nye mikroskopimetoder til egnede dyresygdomsmodeller for at udforske nyrernes dynamiske fysiologi er fortsat en udfordring. Rotter med overfladeglomeruli giver en unik mulighed for at undersøge fysiologiske og patofysiologiske processer ved hjælp af intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantificering af glomerulær kapillær blodgennemstrømning og vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og betændelse er blot nogle af de processer, der kan studeres. Derudover giver transgene rotter, dvs. podocytter mærket med fluorescerende farvestoffer og andre molekylære biomarkørmetoder, øget opløsning til direkte overvågning og kvantificering af protein-proteininteraktioner og virkningerne af specifikke molekylære ændringer.
Hos mus, der mangler overfladeglomeruli efter fire uger, er ensidig ureteral obstruktion (UUO) i flere uger blevet brugt til at inducere overfladeglomeruli. Da denne induktionsmodel ikke tillader baselinestudier, kvantificerede vi virkningerne af UUO på glomerulære processer i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) rotter, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold. UUO-modellen i fem uger eller mere inducerede signifikante ændringer i brutto nyremorfologi, den peritubulære og glomerulære mikrovaskulatur samt strukturen og funktionen af rørformet epitel. Glomerulær og peritubulær rød blodlegeme (RBC) flow faldt signifikant (p < 0,01), sandsynligvis på grund af den signifikante stigning i overholdelsen af hvide blodlegemer (WBC'er) inden for glomerulære og peritubulære kapillærer. Den glomerulære sigtningskoefficient for albumin steg fra 0,015 ± 0,002 i ubehandlede MWF'er til 0,045 ± 0,05 i 5 uger gamle UUO MWF-rotter. Tolv ugers UUO resulterede i yderligere stigninger i overfladeglomerulær densitet og glomerulær sigtningskoefficient (GSC) for albumin. Fluorescerende albumin filtreret over glomeruli blev ikke reabsorberet af de proksimale tubuli. Disse data tyder på, at brug af UUO til at inducere overfladeglomeruli begrænser evnen til at studere og fortolke normale glomerulære processer og sygdomsændringer.
Forståelse af glomerulære processer, især podocytbiologi, har været et mål i over 50 år. München Wistar rotter med overfladeglomeruli har spillet en central rolle i disse undersøgelser, herunder mikropunkturundersøgelser, for at forstå mange aspekter af fysiologiske og patologiske processer 1,2,3. Udnyttelsen af mikroskopi til at studere glomerulære komponenter intravitalt var begrænset på grund af virkningerne af fototoksicitet indtil fremkomsten af 2-fotonmikroskopi, der minimerede denne toksiske eksponering og øgede penetrationsdybden 1,2. Sammen med hurtige fremskridt inden for computerhardware og -software har dette givet mulighed for tredimensionelle (3D) og firedimensionelle (tids)studier i timevis i en enkelt indstilling 1,4,5.
Kvantificeringen af glomerulær kapillær blodgennemstrømning, vasokonstriktion og dilatation som reaktion på lægemidler, permeabilitet og virkningerne af ladning på permeabilitet og inflammation er blot nogle af de glomerulære processer, der er blevet undersøgt. Derudover kan S1-segmentet af det proksimale rør identificeres, og forskellene i opførsel af S1 og S2 rørformet epitel kan kvantificeres 1,4. Undersøgelser på mus, især med den universelle tilgængelighed af musetransgene faciliteter, har ført til hurtige fremskridt i forståelsen af molekylærbiologien af glomerulære sygdomsprocesser. Individuelle proteiner er ansvarlige for glomerulær dysfunktion i knockout-undersøgelser, især med hensyn til proteinuri 6,7,8. Anvendelsen af musemodeller til glomerulære billeddannelsesundersøgelser har imidlertid været begrænset, da glomeruli er mere end 100 μm under overfladen i de mange undersøgte stammer9.
Dette har fået efterforskere til at udvikle og bruge musemodeller, hvilket resulterer i overfladeglomeruli, der kan studeres. Den mest almindelige model er brugen af komplet UUO10,11,12. I slutningen af den forlængede UUO-periode er der talrige overfladeglomeruli i musenyrer, der kan og er blevet undersøgt13,14. Der har ikke været nogen baseline- eller kontrolundersøgelse i disse musestudier for at bestemme virkningerne af langvarig UUO på glomerulær biologi. Da dette er en alvorlig og langvarig skadesmodel, der resulterer i hurtig fibrose og kortikal ødelæggelse10,11,12, antog vi, at der ville være virkninger på glomerulære processer og funktion. For at besvare dette spørgsmål blev München Wistar Fromter (MWF) rotter med overfladeglomeruli brugt til at studere kontrol/baseline parametre, og baseline fundet blev sammenlignet med glomerulære undersøgelser i MWF rotter efter fem ugers UUO. Vi undersøgte også Sprague Dawley (SD) rotter, der ikke har overfladeglomeruli efter UUO. Resultaterne indikerer, at 5 ugers UUO i MWF- og SD-rotter faktisk øger antallet af overfladeglomeruli. Disse var imidlertid unormale glomeruli med markante ændringer i glomerulær blodgennemstrømning, inflammation og makromolekylepermeabilitet og størrelse.
Undersøgelsen af glomerulær fysiologi har set mange forskellige tilgange, især brugen af mikropunktur, perfusion af isolerede glomeruli og mikroskopi. Tilgængeligheden af overfladeglomeruli i München Wistar rotter, Fromter og Simonsen stammer, har tilladt in vivo dynamiske undersøgelser. En vigtig note til efterforskere, der vedtager denne teknologi, er behovet for at indstille erhvervelsesparametre for at opretholde ensartede billeder mellem undersøgelser, så autofluorescensen i væv forbliver konsistent. Brug af en dual-pass fluorescein / rhodamin epifluorescensterning og justering af forstærkningsindstillinger til de grønne og røde emissionskanaler for at efterligne på computerskærmen, hvad der ses gennem okularerne, vil sikre en ensartet farvesignatur i autofluorescensen selv mellem forskellige mikroskopsystemer.
Fromter-stammen er blevet brugt i vid udstrækning, da den har et reduceret antal samlede glomeruli, ~ 75% normal, og mændene udvikler spontant hypertension omkring 12 uger med progressiv proteinuri og efterfølgende fokal glomerulær sklerose, der til sidst dør af nyresvigt12. Brugen af disse rotter og tilføjelsen af 2-fotonmikroskopi med dens reducerede fototoksicitet, forbedrede penetrationsdybde og evnen til at se flere fluorescerende sonder samtidig banede vejen for nye opdagelser 1,4,5. Med udviklingen af computerhardware og -software er kvantitative data nu standarden for alle 2-fotonlaboratorier. Flere kvantitative teknikker er blevet udviklet og anvendt til glomerulære, proksimale tubuli-, vaskulære og interstitielle processer under fysiologiske og sygdomstilstande 1,4,5,27,28,29,30.
Transgene museproduktionsfaciliteter tilføjede en ny dimension til studiet af nyrefysiologi og patologi, og det var kun et spørgsmål om tid, før dette blev kombineret med 2-fotonmikroskopi for yderligere at afgrænse betydningen af specifikke genprodukter i nyrestruktur og funktion. Imidlertid er museglomeruli, undtagen hos meget unge mus, placeret over 100 μm fra overfladen af nyren9. To-fotonmikroskopi udføres bedst i en dybde på mellem 20 og 50 μm som opløsning, og fluorescensintensiteten falder hurtigt derefter på grund af lysspredning af udsendt lys og absorption fra interaktion med hæmoglobin. Derfor var det nødvendigt at inducere overfladeglomeruli. Den almindeligt anvendte tilgang er en langvarig ensidig obstruktionsmodel i 12 uger. Da disse modeller ikke tillader baseline-bestemmelse, er det ikke muligt at adskille virkningerne af UUO fra den proces, der undersøges.
Ved hjælp af MWF-rotter kan man sammenligne baseline glomerulær funktion med den følgende UUO. Denne UUO-model er kendt for at fremkalde betændelse og en hurtig fibrose og er blevet brugt til at studere CKD og fibrose10,11,12. Som forventet var der en stigning i overfladeglomeruli hos både MWF- og SD-rotter. Desuden var de kvantitative resultater, der blev opnået efter UUO for MWF- og SD-rotterne, meget sammenlignelige. Reduktionen i blodgennemstrømningen registreret her var tidligere blevet rapporteret sammenlignet med mikroskopiske data efter UUO med mikropunkturdata3. Det var også velkendt, at rørformet og interstitiel histologi er markant ændret, og PT’erne er for det meste ikke-funktionelle, som rapporteret her, med mangel på albuminendocytose. Undersøgelserne i figur 2 og figur 3 viser en dramatisk reduktion i RBC-strømningshastigheden i glomerulære og peritubulære kapillærer og forbedret WBC-vedhæftning. Reduktionerne i flow skyldes sandsynligvis kapillærblokering fra WBC-adhæsions- og rouleauxformationer.
For yderligere at evaluere inflammation kvantificerede vi albuminpermeabilitet og viste, at det steg ti gange. Derudover viste isoleret glomeruli, at mRNA-ekspression steg for mange gener, der tidligere var kendt for at være øget i nyrebetændelse i en række nyresygdomstilstande 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Stigningerne i glomerulær overfladetæthed og albuminpermeabilitet var progressive, som det fremgår af de 12-ugers UUO-data. De nuværende data er de første til direkte at vise, at glomeruli gennemgår betydelige strukturelle skader, inflammation og molekylære ændringer i UUO-modellen. Resultaterne er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse af hele nyrevæv, der analyserede fårnyrebiopsier efter UUO og fandt flere inflammationsmarkører forhøjet19. De nuværende resultater indikerer, at der findes markant betændelse i glomeruli, der tidligere kun var kendt for kortikalt væv.
De nuværende data adskiller sig fra tidligere undersøgelser på mus, hvor der ikke blev fundet ændringer i adhæsionsmolekyleekspression, komplementaflejring og neutrofil infiltration mellem 12-ugers posthydronefrotisk og normal glomeruli31. Derudover brugte Hickey-laboratoriet den 12-ugers UUO-model til at studere immunreaktioner i glomeruli hos mus. De fandt ingen forskelle i neutrofil infiltration mellem fire uger gamle museglomeruli og postobstruktiv glomeruli32,33. Disse senere undersøgelser blev udført, efter at bækkenet i den blokerede nyre blev drænet for urin. Vi gjorde ikke dette, da vi ønskede at bestemme effekten af UUO på glomerulær funktion, som det ville være in vivo, uden kunstigt at fjerne væsken, der forårsager obstruktionen. Endelig erstattes brugen af UUO i mus med billeddannelse glomeruli på mere end 100 μm under overfladen. Selvom det er muligt, er der en afvejning af opløsning og intensitet, begge reduceres betydeligt, når man går ud over 50 μm34.
De præsenterede resultater er ikke overraskende, hvis man sammenstykker dataene fra den eksisterende litteratur om histologiske ændringer, dannelse af atubulær glomeruli, inflammation, fibrose, hæmodynamik10,11,12. De præsenterede data, herunder WBC-vedhæftning, rouleauxformationer, glomerulære molekylære inflammationsmarkører og øget albuminpermeabilitet, indikerer yderligere den omfattende inflammation, der pågår i denne UUO-model, selv efter fem uger og også til stede ved tolv uger. Det er klart, at kronisk UUO ikke er en fysiologisk tilstand, og brugen af UUO til at inducere overfladeglomeruli repræsenterer en skademodel. MWF-rotterne, som har overfladeglomeruli under fysiologiske forhold, kan undersøges i længderetningen, når der opstår skade. Det er muligt at generere transgene rotter, og mange efterforskere skaber dem med biosensorer for at stille specifikke spørgsmål. Især Medical College of Wisconsin har nu en koloni af MWF-rotter og har lavet transgene rotter med det formål at studere glomerulære processer under fysiologiske og patologiske forhold. Disse MWF-rotter giver en fantastisk mulighed for at studere glomerulære processer hos normale, syge og genetisk ændrede rotter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 og P30DK079312 (til B.A.M.). Vi takker personalet på Genomics Core Facility i Research Technology Support Facility (RTSF) ved Michigan State University for at udføre Nanostring-analysen.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Electric heating pad | Sunbeam | Kroger | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat#72930 | |
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope | Leica Microsystems | Note: Version 7.1r1 | |
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser | Spectra-Physics | NA | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
Reptitherm Undertank Heater | Zoomed | Amazon | |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns) | Qiagen | 74204 | |
RPE buffer | Qiagen | 1018013 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |