التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة
Summary
تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة للإنتاج السريع لحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة مع البروتينات الهيكلية الخلوية المغلفة. تثبت هذه الطريقة أنها مفيدة لإعادة تشكيل الهياكل الخلوية الهيكلية من أسفل إلى أعلى في الحبس والتفاعلات بين الهيكل الخلوي والغشاء.
Abstract
كثيرا ما تستخدم الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كنماذج للأغشية البيولوجية ، وبالتالي فهي أداة رائعة لدراسة العمليات الخلوية المتعلقة بالأغشية في المختبر. في السنوات الأخيرة ، أثبت التغليف داخل GUVs أنه نهج مفيد لتجارب إعادة التشكيل في بيولوجيا الخلية والمجالات ذات الصلة. إنه يحاكي بشكل أفضل ظروف الحبس داخل الخلايا الحية ، بدلا من إعادة التكوين الكيميائي الحيوي التقليدي. غالبا ما لا يكون من السهل تنفيذ طرق التغليف داخل GUVs ، ويمكن أن تختلف معدلات النجاح اختلافا كبيرا من مختبر إلى آخر. إحدى التقنيات التي أثبتت نجاحها في تغليف أنظمة البروتين الأكثر تعقيدا تسمى تغليف واجهة القطيرات المستمرة (cDICE). هنا ، يتم تقديم طريقة قائمة على cDICE لتغليف البروتينات الهيكلية الخلوية بسرعة في GUVs مع كفاءة تغليف عالية. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم إنشاء قطرات أحادية الطبقة من الدهون عن طريق استحلاب محلول بروتيني ذي أهمية في خليط من الدهون / الزيت. بعد إضافتها إلى غرفة دوارة مطبوعة 3D ، تمر هذه القطرات أحادية الطبقات الدهنية عبر طبقة أحادية دهنية ثانية في واجهة مائية / زيتية داخل الغرفة لتشكيل GUVs التي تحتوي على نظام البروتين. تبسط هذه الطريقة الإجراء العام للتغليف داخل GUVs وتسرع العملية ، وبالتالي تسمح لنا بحصر ومراقبة التطور الديناميكي لتجميع الشبكة داخل الحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية. هذه المنصة مفيدة لدراسة ميكانيكا تفاعلات غشاء الهيكل الخلوي في الحبس.
Introduction
تستخدم مقصورات الدهون ثنائية الطبقة كخلايا اصطناعية نموذجية لدراسة التفاعلات العضوية المغلقة والعمليات القائمة على الأغشية أو كوحدات حاملة في تطبيقات توصيل الأدوية 1,2. تتطلب البيولوجيا من أسفل إلى أعلى مع المكونات النقية الحد الأدنى من الأنظمة التجريبية لاستكشاف الخصائص والتفاعلات بين الجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون 3,4. ومع ذلك ، مع تقدم هذا المجال ، هناك حاجة متزايدة لأنظمة تجريبية أكثر تعقيدا تقلد بشكل أفضل الظروف في الخلايا البيولوجية. التغليف في GUVs هو نهج عملي يمكن أن يوفر بعض هذه الخصائص الشبيهة بالخلايا من خلال توفير طبقة ثنائية من الدهون قابلة للتشوه ونفاذية بشكل انتقائي ومساحة تفاعل ضيقة. على وجه الخصوص ، في المختبر إعادة تشكيل الأنظمة الهيكلية الخلوية ، كنماذج للخلايا الاصطناعية ، يمكن أن تستفيد من التغليف في مقصورات الغشاء5. ترتبط العديد من البروتينات الهيكلية الخلوية وتتفاعل مع غشاء الخلية. نظرا لأن معظم التجميعات الهيكلية الخلوية تشكل هياكل تمتد عبر كامل الخلية ، يتم تحديد شكلها بشكل طبيعي بواسطة الحبس بحجم الخلية6.
يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد GUVs ، مثل التورم 7,8 ، واندماج الحويصلة الصغيرة9,10 ، ونقل المستحلب11,12 ، والنفث النبضي 13 ، وغيرها من طرق الموائع الدقيقة 14,15. على الرغم من أن هذه الأساليب لا تزال تستخدم ، إلا أن لكل منها حدودها. وبالتالي ، فإن اتباع نهج قوي ومباشر مع غلة عالية من تغليف GUV أمر مرغوب فيه للغاية. على الرغم من أن تقنيات مثل التورم التلقائي والتورم الكهربائي معتمدة على نطاق واسع لتشكيل GUVs ، إلا أن هذه الطرق متوافقة في المقام الأول مع تركيبات الدهون المحددة16 ، والمخازن المؤقتة منخفضة تركيز الملح 17 ، والحجم الجزيئي المغلف الأصغر18 ، وتتطلب حجما كبيرا من الكفائف. إن دمج العديد من الحويصلات الصغيرة في GUV غير موات بطبيعته ، مما يتطلب خصوصية في تركيبات الدهون المشحونة9 و / أو العوامل الخارجية المسببة للاندماج ، مثل الببتيدات19 أو غيرها من المواد الكيميائية. من ناحية أخرى ، قد يتطلب نقل المستحلب وطرق الموائع الدقيقة تثبيت القطيرات من خلال إزالة الفاعل بالسطح والمذيبات بعد تكوين الطبقة الثنائية ، على التوالي18,20. يفرض تعقيد الإعداد التجريبي والجهاز في تقنيات الموائع الدقيقة مثل النفث النبضي تحديا إضافيا21. cDICE هي طريقة قائمة على المستحلب مشتقة من مبادئ مماثلة تحكم نقل المستحلب22,23. يتم تقسيم المحلول المائي (المحلول الخارجي) وخليط الدهون والزيت إلى طبقات بواسطة قوى الطرد المركزي في غرفة أسطوانية دوارة (غرفة cDICE) تشكل واجهة مشبعة بالدهون. يؤدي نقل قطرات مائية أحادية الطبقة من الدهون إلى غرفة cDICE الدوارة إلى سحاب طبقة ثنائية الطبقة حيث تعبر القطرات الواجهة المشبعة بالدهون إلى المحلول المائي الخارجي22,24. نهج cDICE هو تقنية قوية لتغليف GUV. مع الطريقة المعدلة المقدمة ، لا يتم تحقيق غلة الحويصلة العالية النموذجية ل cDICE مع وقت تغليف أقصر بكثير (بضع ثوان) فحسب ، بل يتم تقليل وقت توليد GUV الذي يسمح بمراقبة العمليات المعتمدة على الوقت (على سبيل المثال ، تكوين شبكة actin cytoskeletal network) بشكل كبير. يستغرق البروتوكول حوالي 15-20 دقيقة من البداية إلى جمع GUV وتصويرها. هنا ، يتم وصف توليد GUV باستخدام طريقة cDICE المعدلة لتغليف الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs). ومع ذلك ، فإن التقنية المقدمة قابلة للتطبيق لتغليف مجموعة واسعة من التفاعلات البيولوجية والتفاعلات الغشائية ، من تجميع البوليمرات الحيوية إلى التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا إلى نقل البضائع القائمة على الاندماج الغشائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استكشاف طرق مختلفة لتوليد GUVs لإنشاء خلايا اصطناعية ومع ذلك ، فإن تعقيد الإجراءات ، والوقت الممتد لتحقيق التغليف ، وتقييد أنواع الدهون والتركيب الجزيئي للغلاف ، والحاجة إلى مواد كيميائية غير فسيولوجية لتسهيل التغليف ، وانخفاض إنتاجية GUV ، وعدم الاتساق في كفاءة التغليف لا تزال تشكل تحدي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف APL بالدعم المقدم من زمالة Humboldt Research للباحثين ذوي الخبرة ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (1939310 و 1817909) والمعاهد الوطنية للصحة (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
