Hurtig indkapsling af rekonstitueret cytoskelet inde i gigantiske unilamellare vesikler
Summary
Denne artikel introducerer en simpel metode til hurtig produktion af gigantiske unilmellære vesikler med indkapslede cytoskeletale proteiner. Metoden viser sig at være nyttig til bottom-up rekonstitution af cytoskeletale strukturer i indespærring og cytoskelet-membraninteraktioner.
Abstract
Gigantiske unilamellare vesikler (GUV’er) bruges ofte som modeller af biologiske membraner og er derfor et godt værktøj til at studere membranrelaterede cellulære processer in vitro. I de senere år har indkapsling inden for GUV’er vist sig at være en nyttig tilgang til rekonstitutionseksperimenter inden for cellebiologi og beslægtede områder. Det efterligner bedre indespærringsforhold inde i levende celler i modsætning til konventionel biokemisk rekonstitution. Metoder til indkapsling inde i GUV’er er ofte ikke lette at implementere, og succesraten kan variere betydeligt fra laboratorium til laboratorium. En teknik, der har vist sig at være vellykket til indkapsling af mere komplekse proteinsystemer, kaldes kontinuerlig dråbegrænseflade, der krydser indkapsling (cDICE). Her præsenteres en cDICE-baseret metode til hurtigt indkapsling af cytoskeletale proteiner i GUV’er med høj indkapslingseffektivitet. I denne metode genereres først lipid-monolagsdråber ved at emulgere en proteinopløsning af interesse i en lipid / olieblanding. Efter at være blevet tilsat i et roterende 3D-trykt kammer, passerer disse lipid-monolagede dråber derefter gennem et andet lipidmonolag ved en vand / oliegrænseflade inde i kammeret for at danne GUV’er, der indeholder proteinsystemet. Denne metode forenkler den overordnede procedure for indkapsling inden for GUV’er og fremskynder processen og giver os således mulighed for at begrænse og observere den dynamiske udvikling af netværkssamling inde i lipiddobbeltlags vesikler. Denne platform er praktisk til at studere mekanikken i cytoskelet-membraninteraktioner i indespærring.
Introduction
Lipid-dobbeltlagsrum anvendes som syntetiske modelceller til undersøgelse af lukkede organiske reaktioner og membranbaserede processer eller som bærermoduler i lægemiddelleveringsapplikationer 1,2. Bottom-up biologi med oprensede komponenter kræver minimale eksperimentelle systemer til at udforske egenskaber og interaktioner mellem biomolekyler, såsom proteiner og lipider 3,4. Men med udviklingen af feltet er der et øget behov for mere komplekse eksperimentelle systemer, der bedre efterligner betingelserne i biologiske celler. Indkapsling i GUV’er er en praktisk tilgang, der kan tilbyde nogle af disse cellelignende egenskaber ved at tilvejebringe et deformerbart og selektivt permeabelt lipiddobbeltlag og et begrænset reaktionsrum. Især in vitro-rekonstitution af cytoskeletale systemer, som modeller af syntetiske celler, kan drage fordel af indkapsling i membranrum5. Mange cytoskeletale proteiner binder og interagerer med cellemembranen. Da de fleste cytoskeletale samlinger danner strukturer, der spænder over hele cellen, bestemmes deres form naturligt af cellestørrelse indespærring6.
Forskellige metoder anvendes til at generere GUV’er, såsom hævelse 7,8, lille vesikelfusion 9,10, emulsionsoverførsel 11,12, pulserende jetting13 og andre mikrofluidiske tilgange14,15. Selvom disse metoder stadig bruges, har hver sine begrænsninger. Således er en robust og ligetil tilgang med et højt udbytte af GUV-indkapsling yderst ønskelig. Selvom teknikker som spontan hævelse og elektroswelling er bredt anvendt til dannelse af GUV’er, er disse metoder primært kompatible med specifikke lipidsammensætninger16, buffere med lav saltkoncentration17, mindre indkapslingsmiddel molekylær størrelse18 og kræver et stort volumen af indkapslingsmidlet. Sammensmeltning af flere små vesikler til en GUV er i sagens natur energetisk ugunstig, hvilket kræver specificitet i ladede lipidsammensætninger9 og / eller eksterne fusionsinducerende midler, såsom peptider19 eller andre kemikalier. Emulsionsoverførsel og mikrofluidiske metoder kan derimod kræve dråbestabilisering gennem fjernelse af overfladeaktivt stof og opløsningsmiddel efter dannelse af tolag, henholdsvis18,20. Kompleksiteten af eksperimentel opsætning og enhed i mikrofluidiske teknikker såsom pulserende jetting pålægger en yderligere udfordring21. cDICE er en emulsionsbaseret metode afledt af lignende principper for emulsionsoverførsel22,23. En vandig opløsning (ydre opløsning) og en lipid-olieblanding stratificeres af centrifugalkræfter i et roterende cylindrisk kammer (cDICE-kammer), der danner en lipidmættet grænseflade. Shuttling lipid monolayered vandige dråber i det roterende cDICE kammer resulterer i lynlåsning af et dobbeltlag, da dråber krydser den lipidmættede grænseflade ind i den ydre vandige opløsning22,24. cDICE-tilgangen er en robust teknik til GUV-indkapsling. Med den præsenterede modificerede metode opnås ikke kun det høje vesikleudbytte, der er typisk for cDICE med en signifikant kortere indkapslingstid (et par sekunder), men GUV-genereringstid, der muliggør observation af tidsafhængige processer (f.eks. Actin cytoskeletal netværksdannelse) reduceres signifikant. Protokollen tager ca. 15-20 minutter fra starten til GUV-indsamling og billeddannelse. Her beskrives GUV-generering ved hjælp af den modificerede cDICE-metode til indkapsling af actin og actinbindende proteiner (ABP’er). Den præsenterede teknik er imidlertid anvendelig til indkapsling af en bred vifte af biologiske reaktioner og membraninteraktioner, fra samling af biopolymerer til cellefri proteinekspression til membranfusionsbaseret lastoverførsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskellige metoder til generering af GUV’er er blevet undersøgt til oprettelse af syntetiske celler Imidlertid er kompleksiteten af procedurerne, forlænget tid til at opnå indkapsling, begrænsning af lipidtyper og molekylær sammensætning af indkapslingsmiddel, behov for ikke-fysiologiske kemikalier til at lette indkapsling, lavt GUV-udbytte og uoverensstemmelser i indkapslingseffektiviteten fortsat udfordre forskere på dette område. I betragtning af den brede vifte af potentielle undersøgelser, der kan påbegyn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL anerkender støtte fra et Humboldt Research Fellowship for Erfarne Forskere og fra National Science Foundation (1939310 and 1817909) og National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
