Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes
Summary
Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.
Abstract
Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden vaak gebruikt als modellen van biologische membranen en zijn dus een geweldig hulpmiddel om membraangerelateerde cellulaire processen in vitro te bestuderen. In de afgelopen jaren is inkapseling binnen GUV’s een nuttige benadering gebleken voor reconstitutie-experimenten in celbiologie en aanverwante gebieden. Het bootst beter de opsluitingsomstandigheden in levende cellen na, in tegenstelling tot conventionele biochemische reconstitutie. Methoden voor inkapseling in GUVs zijn vaak niet eenvoudig te implementeren en slagingspercentages kunnen aanzienlijk verschillen van laboratorium tot laboratorium. Een techniek die succesvol is gebleken voor het inkapselen van complexere eiwitsystemen wordt continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) genoemd. Hier wordt een op cDICE gebaseerde methode gepresenteerd voor het snel inkapselen van cytoskeletale eiwitten in GUVs met een hoge inkapselingsefficiëntie. In deze methode worden eerst lipide-monolaagdruppels gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren die van belang is in een lipide / oliemengsel. Nadat ze zijn toegevoegd aan een roterende 3D-geprinte kamer, gaan deze lipide-monolagige druppels vervolgens door een tweede lipide monolaag op een water / olie-interface in de kamer om GUVs te vormen die het eiwitsysteem bevatten. Deze methode vereenvoudigt de algemene procedure van inkapseling binnen GUV’s en versnelt het proces, en stelt ons dus in staat om de dynamische evolutie van netwerkassemblage in lipide bilayer blaasjes te beperken en te observeren. Dit platform is handig voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.
Introduction
Lipide dubbellaagse compartimenten worden gebruikt als model synthetische cellen voor het bestuderen van ingesloten organische reacties en op membraan gebaseerde processen of als dragermodules in toepassingen voor medicijnafgifte 1,2. Bottom-up biologie met gezuiverde componenten vereist minimale experimentele systemen om eigenschappen en interacties tussen biomoleculen, zoals eiwitten en lipiden, te onderzoeken 3,4. Met de vooruitgang van het veld is er echter een toegenomen behoefte aan complexere experimentele systemen die de omstandigheden in biologische cellen beter imiteren. Inkapseling in GUVs is een praktische benadering die een aantal van deze celachtige eigenschappen kan bieden door een vervormbare en selectief doorlatende lipide bilayer en een beperkte reactieruimte te bieden. Met name in vitro reconstitutie van cytoskeletsystemen, als modellen van synthetische cellen, kan baat hebben bij inkapseling in membraancompartimenten5. Veel cytoskeletale eiwitten binden en interageren met het celmembraan. Aangezien de meeste cytoskeletale assemblages structuren vormen die het geheel van de cel overspannen, wordt hun vorm natuurlijk bepaald door celgrote opsluiting6.
Verschillende methoden worden gebruikt om GUVs te genereren, zoals de zwelling 7,8, kleine blaasjesfusie 9,10, emulsieoverdracht11,12, gepulseerde jetting13 en andere microfluïdische benaderingen14,15. Hoewel deze methoden nog steeds worden gebruikt, heeft elk zijn beperkingen. Daarom is een robuuste en eenvoudige aanpak met een hoog rendement van GUV-inkapseling zeer wenselijk. Hoewel technieken zoals spontane zwelling en elektroswelling op grote schaal worden toegepast voor de vorming van GUVs, zijn deze methoden voornamelijk compatibel met specifieke lipidesamenstellingen16, buffers met lage zoutconcentraties17, kleinere encapsulant moleculaire grootte18 en vereisen ze een groot volume van het inkapselingsmiddel. Het fuseren van meerdere kleine blaasjes tot een GUV is inherent energetisch ongunstig, waardoor specificiteit vereist is in geladen lipidesamenstellingen9 en / of externe fusie-inducerende middelen, zoals peptiden19 of andere chemicaliën. Emulsieoverdracht en microfluïdische methoden kunnen daarentegen druppelstabilisatie vereisen door verwijdering van oppervlakteactieve stoffen en oplosmiddelen na dubbellaagse vorming, respectievelijk18,20. De complexiteit van experimentele opstelling en apparaat in microfluïdische technieken zoals gepulseerde jetting vormen een extra uitdaging21. cDICE is een op emulsie gebaseerde methode die is afgeleid van vergelijkbare principes voor emulsieoverdracht22,23. Een waterige oplossing (buitenoplossing) en een lipide-oliemengsel worden gestratificeerd door centrifugale krachten in een roterende cilindrische kamer (cDICE-kamer) die een lipide verzadigd interface vormen. Het dichtknijpen van lipide monolaged waterige druppels in de roterende cDICE-kamer resulteert in het ritsen van een dubbellaag terwijl druppels de lipide-verzadigde interface doorkruisen naar de buitenste waterige oplossing22,24. De cDICE-aanpak is een robuuste techniek voor GUV-inkapseling. Met de gepresenteerde gemodificeerde methode wordt niet alleen de hoge blaasjesopbrengst bereikt die typisch is voor cDICE met een aanzienlijk kortere inkapselingstijd (enkele seconden), maar wordt ook de GUV-generatietijd bereikt die de observatie van tijdsafhankelijke processen mogelijk maakt (bijv. Actine cytoskeletale netwerkvorming) aanzienlijk verminderd. Het protocol duurt ongeveer 15-20 minuten vanaf het begin tot GUV-verzameling en beeldvorming. Hier wordt GUV-generatie beschreven met behulp van de gemodificeerde cDICE-methode voor het inkapselen van actine en actine-bindende eiwitten (ABPs). De gepresenteerde techniek is echter toepasbaar voor het inkapselen van een breed scala aan biologische reacties en membraaninteracties, van de assemblage van biopolymeren tot celvrije eiwitexpressie tot op membraanfusie gebaseerde ladingoverdracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende methoden voor het genereren van GUVs zijn onderzocht voor de creatie van synthetische cellen De complexiteit van de procedures, de langere tijd om inkapseling te bereiken, beperking van lipidetypen en moleculaire samenstelling van het inkapselingsmiddel, behoefte aan niet-fysiologische chemicaliën om inkapseling te vergemakkelijken, lage GUV-opbrengst en inconsistenties in inkapselingsefficiëntie blijven onderzoekers op dit gebied uitdagen. Gezien het brede scala aan potentiële studies die kunnen worden …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL erkent steun van een Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers en van de National Science Foundation (1939310 and 1817909) en National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
