Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Summary

Cet article présente une méthode simple pour la production rapide de vésicules unilamellaires géantes avec des protéines cytosquelettiques encapsulées. La méthode s’avère utile pour la reconstitution ascendante des structures cytosquelettiques dans le confinement et les interactions cytosquelette-membrane.

Abstract

Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont fréquemment utilisées comme modèles de membranes biologiques et constituent donc un excellent outil pour étudier les processus cellulaires liés à la membrane in vitro. Ces dernières années, l’encapsulation dans les GUV s’est avérée être une approche utile pour les expériences de reconstitution en biologie cellulaire et dans des domaines connexes. Il imite mieux les conditions de confinement à l’intérieur des cellules vivantes, par opposition à la reconstitution biochimique conventionnelle. Les méthodes d’encapsulation à l’intérieur des GUV ne sont souvent pas faciles à mettre en œuvre, et les taux de réussite peuvent différer considérablement d’un laboratoire à l’autre. Une technique qui s’est avérée efficace pour encapsuler des systèmes protéiques plus complexes est appelée encapsulation croisée d’interface gouttelette continue (cDICE). Ici, une méthode basée sur cDICE est présentée pour encapsuler rapidement des protéines cytosquelettiques dans des GUV avec une efficacité d’encapsulation élevée. Dans cette méthode, tout d’abord, les gouttelettes lipido-monocouches sont générées en émulsionnant une solution protéique d’intérêt dans un mélange lipide/huile. Après avoir été ajoutées dans une chambre rotative imprimée en 3D, ces gouttelettes monocouches lipidiques passent ensuite à travers une deuxième monocouche lipidique à une interface eau/huile à l’intérieur de la chambre pour former des GUV qui contiennent le système protéique. Cette méthode simplifie la procédure globale d’encapsulation dans les GUV et accélère le processus, et nous permet ainsi de confiner et d’observer l’évolution dynamique de l’assemblage du réseau à l’intérieur des vésicules bicouches lipidiques. Cette plate-forme est pratique pour étudier la mécanique des interactions cytosquelette-membrane en confinement.

Introduction

Les compartiments bicouches lipidiques sont utilisés comme modèles de cellules synthétiques pour l’étude des réactions organiques fermées et des processus membranaires ou comme modules porteurs dans les applications d’administration^de médicaments ^1,2. La biologie ascendante avec des composants purifiés nécessite un minimum de systèmes expérimentaux pour explorer les propriétés et les interactions entre les biomolécules, telles que les protéines et les lipides ^3,4. Cependant, avec les progrès du domaine, il y a un besoin accru de systèmes expérimentaux ....

Protocol

1. Préparation du mélange huile-lipides

REMARQUE: L’étape doit être effectuée dans une hotte en suivant toutes les directives de sécurité pour la manipulation du chloroforme.

1. Prendre 0,5 mL de chloroforme dans un flacon en verre de 15 mL. Ajouter 88 μL de 25 mg/mL de dioléoyl-phosphocholine (DOPC), 9,3 μL de 50 mg/mL de cholestérol et 5 μL de 1 mg/mL de dioléoyl-phosphoéthanolamine-lissamine B (rhodamine PE) (voir tableau des matériaux) dans le flacon en verre de 15 ml.
   REMARQUE: Les fractions molaires finales de DOPC et de cholestérol dans l’huile de silicone / huile minérale sont de 69,9% et ....

Results

Pour démontrer la génération réussie de GUV cytosquelettiques à l’aide du protocole actuel, des structures de faisceau fascine-actine dans les GUV ont été reconstituées. La fascine est un réticulant court de filaments d’actine qui forme des faisceaux d’actine rigides alignés en parallèle et est purifié à partir d’E. coli sous forme de protéine de fusion glutathion-S-transférase (GST)²⁶. 5 μM d’actine ont d’abord été reconstitués, dont 0,53 μM d’actine ATTO488 dans le tampon de polymérisat.......

Discussion

Différentes méthodes de génération de GUV ont été explorées pour la création de cellules synthétiques Cependant, la complexité des procédures, le temps prolongé pour atteindre l’encapsulation, la restriction des types de lipides et de la composition moléculaire de l’encapsulant, le besoin de produits chimiques non physiologiques pour faciliter l’encapsulation, le faible rendement en GUV et les incohérences dans l’efficacité de l’encapsulation ont continué à défier les chercheurs dans ce domaine. Compte tenu du large éven.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipide dans le chloroforme	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actine du muscle squelettique du lapin	Cytosquelette	AKL99-A
ATTO 488-actine du muscle squelettique du lapin	Hypermol	8153-01
Microtubes Axygen (200 µ ; L)	Fisher Scientific	14-222-262	pour la manipulation des ABP
Résine noire	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholestérol (poudre)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Résine transparente	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Unité de scanner confocal	YOKOGAWA	CSU-X1
Milieu à gradient de densité (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
Lipide DOPC sous forme de chloroforme	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	fait maison	N/A
F-buffer	N	/A
Fisherbrand microtubes (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicateur	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	fait maison	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3	caméra Andor	DU-897E-CS0
Huile minérale	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Microscope inversé	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Microscope à huile Objectif	Olumpus	1-U2B933
Huile de silicone	Sigma-Aldrich	317667