Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti
Summary
Questo articolo introduce un metodo semplice per la produzione rapida di vescicole unilamellari giganti con proteine citoscheletriche incapsulate. Il metodo si rivela utile per la ricostituzione bottom-up delle strutture citoscheletriche nelle interazioni confinamento e citoscheletro-membrana.
Abstract
Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono spesso utilizzate come modelli di membrane biologiche e quindi sono un ottimo strumento per studiare i processi cellulari correlati alla membrana in vitro. Negli ultimi anni, l’incapsulamento all’interno dei GUV ha dimostrato di essere un approccio utile per esperimenti di ricostituzione in biologia cellulare e campi correlati. Imita meglio le condizioni di confinamento all’interno delle cellule viventi, al contrario della ricostituzione biochimica convenzionale. I metodi per l’incapsulamento all’interno dei GUV spesso non sono facili da implementare e le percentuali di successo possono differire significativamente da laboratorio a laboratorio. Una tecnica che ha dimostrato di avere successo nell’incapsulare sistemi proteici più complessi è chiamata incapsulamento continuo dell’interfaccia goccioline che attraversa l’incapsulamento (cDICE). Qui, viene presentato un metodo basato su cDICE per incapsulare rapidamente proteine citoscheletriche in GUV con elevata efficienza di incapsulamento. In questo metodo, in primo luogo, le goccioline lipidiche-monostrato vengono generate emulsionando una soluzione proteica di interesse in una miscela lipidico/oleosa. Dopo essere state aggiunte in una camera rotante stampata in 3D, queste goccioline lipidiche-monostrato passano quindi attraverso un secondo monostrato lipidico in un’interfaccia acqua / olio all’interno della camera per formare GUV che contengono il sistema proteico. Questo metodo semplifica la procedura generale di incapsulamento all’interno dei GUV e accelera il processo, e quindi ci consente di confinare e osservare l’evoluzione dinamica dell’assemblaggio della rete all’interno di vescicole lipidiche a doppio strato. Questa piattaforma è utile per studiare la meccanica delle interazioni citoscheletro-membrana nel confinamento.
Introduction
I compartimenti lipidici a doppio strato sono utilizzati come cellule sintetiche modello per lo studio di reazioni organiche chiuse e processi basati su membrana o come moduli portanti in applicazioni di somministrazione di farmaci 1,2. La biologia bottom-up con componenti purificati richiede sistemi sperimentali minimi per esplorare le proprietà e le interazioni tra biomolecole, come proteine e lipidi 3,4. Tuttavia, con l’avanzamento del campo, c’è una maggiore necessità di sistemi sperimentali più complessi che imitino meglio le condizioni nelle cellule biologiche. L’incapsulamento nei VGV è un approccio pratico che può offrire alcune di queste proprietà simili alle cellule fornendo un doppio strato lipidico deformabile e selettivamente permeabile e uno spazio di reazione ristretto. In particolare, la ricostituzione in vitro di sistemi citoscheletrici, come modelli di cellule sintetiche, può trarre beneficio dall’incapsulamento nei compartimenti di membrana5. Molte proteine citoscheletriche si legano e interagiscono con la membrana cellulare. Poiché la maggior parte degli assemblaggi citoscheletrici formano strutture che coprono l’intera cellula, la loro forma è naturalmente determinata dal confinamento delle dimensioni della cellula6.
Diversi metodi sono utilizzati per generare GUV, come il gonfiore 7,8, la fusione di piccole vescicole 9,10, il trasferimento di emulsione 11,12, il getto pulsato13 e altri approcci microfluidici14,15. Sebbene questi metodi siano ancora utilizzati, ognuno ha i suoi limiti. Pertanto, un approccio robusto e diretto con un alto rendimento di incapsulamento GUV è altamente desiderabile. Sebbene tecniche come il gonfiore spontaneo e l’elettroswelling siano ampiamente adottate per la formazione di GUV, questi metodi sono principalmente compatibili con specifiche composizioni lipidiche16, tamponi a bassa concentrazione salina17, dimensioni molecolari incapsulanti più piccole18 e richiedono un volume elevato dell’incapsulante. La fusione di più piccole vescicole in un GUV è intrinsecamente sfavorevole dal punto di vista energetico, richiedendo quindi specificità nelle composizioni lipidiche cariche9 e / o agenti esterni che inducono la fusione, come peptidi19 o altre sostanze chimiche. Il trasferimento di emulsioni e i metodi microfluidici, d’altra parte, possono richiedere la stabilizzazione delle goccioline attraverso la rimozione di tensioattivi e solventi dopo la formazione di due strati, rispettivamente18,20. La complessità della configurazione sperimentale e del dispositivo nelle tecniche microfluidiche come il getto pulsato impone un’ulteriore sfida21. cDICE è un metodo basato sull’emulsione derivato da principi simili che regolano il trasferimento dell’emulsione22,23. Una soluzione acquosa (soluzione esterna) e una miscela lipidico-olio sono stratificate da forze centrifughe in una camera cilindrica rotante (camera cDICE) formando un’interfaccia satura lipidica. Lo spostamento di goccioline acquose lipidiche monostrato nella camera cDICE rotante provoca la compressione di un doppio strato mentre le goccioline attraversano l’interfaccia satura di lipidi nella soluzione acquosa esterna22,24. L’approccio cDICE è una tecnica robusta per l’incapsulamento GUV. Con il metodo modificato presentato, non solo si ottiene l’elevata resa di vescicole tipica del cDICE con un tempo di incapsulamento significativamente più breve (pochi secondi), ma il tempo di generazione di GUV che consente l’osservazione di processi dipendenti dal tempo (ad esempio, la formazione della rete citoscheletrica di actina) è significativamente ridotto. Il protocollo richiede circa 15-20 minuti dall’inizio alla raccolta e all’imaging GUV. Qui, la generazione di GUV è descritta utilizzando il metodo cDICE modificato per incapsulare l’actina e le proteine leganti l’actina (ABP). Tuttavia, la tecnica presentata è applicabile per incapsulare una vasta gamma di reazioni biologiche e interazioni di membrana, dall’assemblaggio di biopolimeri all’espressione proteica senza cellule al trasferimento del carico basato sulla fusione di membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sono stati esplorati diversi metodi di generazione di GUV per la creazione di cellule sintetiche Tuttavia, la complessità delle procedure, il tempo prolungato per raggiungere l’incapsulamento, la restrizione dei tipi lipidici e la composizione molecolare dell’incapsulante, la necessità di sostanze chimiche non fisiologiche per facilitare l’incapsulamento, la bassa resa di GUV e le incoerenze nell’efficienza dell’incapsulamento hanno continuato a sfidare i ricercatori in questo campo. Considerando l’ampia gamma di poten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL riconosce il sostegno di una borsa di ricerca Humboldt per ricercatori esperti e della National Science Foundation (1939310 e 1817909) e del National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
