巨大な単層小胞内の再構成された細胞骨格の迅速なカプセル化
Summary
この記事では、細胞骨格タンパク質を内包した巨大な単層小胞を迅速に生産するための簡単な方法を紹介します。この方法は、閉じ込めおよび細胞骨格 – 膜相互作用における細胞骨格構造のボトムアップ再構成に有用であることが証明されている。
Abstract
巨大な単層小胞(GUV)は、生体膜のモデルとして頻繁に使用されるため、膜関連の細胞プロセスを インビトロで研究するための優れたツールです。近年、GUV内のカプセル化は、細胞生物学および関連分野における再構成実験のための有用なアプローチであることが証明されている。従来の生化学的再構成とは対照的に、生細胞内の閉じ込め条件をよりよく模倣する。GUV内部にカプセル化する方法は、多くの場合、実装が容易ではなく、成功率はラボごとに大きく異なる可能性があります。より複雑なタンパク質系をカプセル化するのに成功することが証明されている1つの技術は、連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)と呼ばれる。ここでは、細胞骨格タンパク質を高い封入効率でGUVに迅速に封入するためのcDICEベースの方法を提示する。この方法では、まず、目的のタンパク質溶液を脂質/油混合物中で乳化することによって、脂質単層液滴を生成する。回転する3Dプリントチャンバに添加された後、これらの脂質単層液滴は、チャンバ内の水/油界面で第2の脂質単分子膜を通過し、タンパク質系を含むGUVを形成する。この方法は、GUV内のカプセル化の全体的な手順を簡素化し、プロセスをスピードアップし、したがって、脂質二重層小胞内のネットワークアセンブリの動的進化を閉じ込めて観察することを可能にする。このプラットフォームは、閉じ込めにおける細胞骨格 – 膜相互作用のメカニズムを研究するのに便利です。
Introduction
脂質二重層コンパートメントは、密閉された有機反応および膜ベースのプロセスを研究するためのモデル合成細胞として、または薬物送達用途におけるキャリアモジュールとして使用される1,2。精製された成分を用いたボトムアップ生物学は、タンパク質や脂質などの生体分子間の特性や相互作用を探求するために最小限の実験システムを必要とする3,4。しかし、この分野の進歩に伴い、生体細胞の条件をよりよく模倣するより複雑な実験システムの必要性が高まっています。GUVsへのカプセル化は、変形可能で選択的に透過性の脂質二重層および閉じ込められた反応空間を提供することによって、これらの細胞様特性のいくつかを提供することができる実用的なアプローチである。特に、細胞骨格系のインビトロ再構成は、合成細胞のモデルとして、膜区画5への封入から利益を得ることができる。多くの細胞骨格タンパク質は細胞膜と結合し、相互作用する。ほとんどの細胞骨格集合体は細胞全体にまたがる構造を形成するので、それらの形状は細胞サイズの閉じ込め6によって自然に決定される。
GUVを生成するために、膨潤7、8、小小胞融合9、10、エマルジョン移送11、12、パルス噴出13、および他のマイクロ流体アプローチ14、15など、異なる方法が使用される。これらの方法はまだ利用されていますが、それぞれに限界があります。したがって、GUVカプセル化の高収率を伴う堅牢で直接的なアプローチが非常に望ましい。自発的膨潤および電気膨潤などの技術がGUVの形成に広く採用されているが、これらの方法は、主に、特定の脂質組成物16、低塩濃度緩衝液17、より小さい封入剤分子サイズ18、および大量の封入剤を必要とする。複数の小さな小胞をGUVに融合させることは、本質的にエネルギー的に好ましくないため、荷電脂質組成物9および/またはペプチド19または他の化学物質などの外部融合誘導剤における特異性を必要とする。一方、エマルジョン転写およびマイクロ流体法は、二重層形成後の界面活性剤および溶媒除去を介した液滴安定化をそれぞれ必要とし得る18、20。パルス噴射などのマイクロ流体技術における実験セットアップおよび装置の複雑さは、さらなる課題21を課す。cDICEは、エマルジョン移送22、23を支配する同様の原理に由来するエマルジョンベースの方法である。水溶液(外液)と脂質-油混合物は、脂質飽和界面を形成する回転円筒チャンバ(cDICEチャンバ)内で遠心力により成層化される。回転するcDICEチャンバ内に脂質単層水性液滴をシャットリングすると、液滴が脂質飽和界面を横切って外側水溶液22、24に入るにつれて二重層のジッピングが生じる。cDICEアプローチは、GUVカプセル化のための堅牢な手法です。提示された改変法では、有意に短い封入時間(数秒)を有するcDICEに典型的な高いベシクル収率が達成されるだけでなく、時間依存プロセスの観察を可能にするGUV生成時間(例えば、アクチン細胞骨格ネットワーク形成)が有意に短縮される。プロトコルは、開始からGUVの収集とイメージングまで約15〜20分かかります。ここで、GUV生成は、アクチンおよびアクチン結合タンパク質(ABP)を封入するための修飾cDICE法を用いて説明される。しかし、提示された技術は、生体高分子の組み立てから無細胞タンパク質発現、膜融合ベースの貨物輸送まで、幅広い生体反応および膜相互作用をカプセル化するために適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
しかしながら、合成細胞の作成のためにGUVを生成する様々な方法が探求されてきたが、手順の複雑さ、カプセル化を達成するまでの時間の延長、封入剤の脂質タイプおよび分子組成の制限、封入を容易にするための非生理学的化学物質の必要性、低いGUV収率、および封入効率の不整合は、この分野の研究者に挑戦し続けている。ボトムアップ合成生物学に着手できる幅広い潜在的な研究を考?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APLは、フンボルト・リサーチ・フェローシップ・フォー・ベテラン・リサーチ・フェローシップ、国立科学財団(1939310および1817909)および国立衛生研究所(R01 EB030031)からの支援を認めています。
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
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