거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화
Summary
이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.
Abstract
거대한 unilamellar vesicles (GUVs)는 생물학적 막의 모델로 자주 사용되므로 시험관 내에서 막 관련 세포 과정을 연구하는 데 훌륭한 도구입니다. 최근 몇 년 동안, GUV 내의 캡슐화는 세포 생물학 및 관련 분야의 재구성 실험에 유용한 접근법임이 입증되었습니다. 그것은 기존의 생화학 적 재구성과는 달리 살아있는 세포 내부의 감금 조건을 더 잘 모방합니다. GUV 내부에 캡슐화하는 방법은 구현하기가 쉽지 않은 경우가 많으며 성공률은 실험실마다 크게 다를 수 있습니다. 더 복잡한 단백질 시스템을 캡슐화하는 데 성공한 것으로 입증 된 한 가지 기술을 연속 액적 인터페이스 교차 캡슐화 (cDICE)라고합니다. 여기에서, 높은 캡슐화 효율로 GUVs에 세포골격 단백질을 신속하게 캡슐화하기 위한 cDICE 기반 방법이 제시된다. 이 방법에서, 첫째, 지질-단층 액적은 지질/오일 혼합물에 관심있는 단백질 용액을 유화시킴으로써 생성된다. 회전하는 3D 인쇄 챔버에 첨가 된 후,이 지질 단층 액적은 챔버 내부의 물 / 오일 계면에서 두 번째 지질 단일층을 통과하여 단백질 시스템을 포함하는 GUV를 형성합니다. 이 방법은 GUV 내 캡슐화의 전반적인 절차를 단순화하고 프로세스 속도를 높여 지질 이중층 소포 내부의 네트워크 어셈블리의 동적 진화를 제한하고 관찰 할 수있게합니다. 이 플랫폼은 감금에서 세포 골격 – 막 상호 작용의 역학을 연구하는 데 편리합니다.
Introduction
지질 이중층 구획은 밀폐 된 유기 반응 및 막 기반 공정을 연구하기위한 모델 합성 세포 또는 약물 전달 응용 프로그램 1,2에서 캐리어 모듈로 사용됩니다. 정제된 성분을 이용한 상향식 생물학은 단백질과 지질 3,4와 같은 생체분자 사이의 특성과 상호작용을 탐구하기 위해 최소한의 실험 시스템을 필요로 한다. 그러나 현장의 발전과 함께 생물학적 세포의 조건을 더 잘 모방하는보다 복잡한 실험 시스템에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. GUVs에서의 캡슐화는 변형가능하고 선택적으로 투과가능한 지질 이중층 및 제한된 반응 공간을 제공함으로써 이러한 세포 유사 특성 중 일부를 제공할 수 있는 실용적인 접근법이다. 특히, 합성 세포의 모델로서 세포골격계의 시험관내 재구성은 막 구획5에 캡슐화함으로써 이익을 얻을 수 있다. 많은 세포골격 단백질은 세포막에 결합하고 상호작용한다. 대부분의 세포골격 어셈블리는 세포 전체에 걸쳐 있는 구조를 형성하기 때문에, 그 형상은 세포 크기의 감금6에 의해 자연적으로 결정된다.
팽윤7,8, 소형 소포 융합9,10, 에멀젼 전달 11,12, 펄스 젯팅 13, 및 다른 미세유체 접근법(14,15)과 같은 GUV를 생성하기 위해 상이한 방법이 사용된다. 이러한 방법은 여전히 활용되지만 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서, 높은 수율의 GUV 캡슐화를 갖는 견고하고 직접적인 접근법이 매우 바람직하다. GUVs의 형성을 위해 자발적 팽윤 및 전기팽윤과 같은 기술이 널리 채택되었지만, 이들 방법은 주로 특정 지질 조성물(16), 낮은 염 농도 완충제(17), 더 작은 캡슐화제 분자 크기(18)와 양립가능하고, 높은 부피의 캡슐화제를 필요로 한다. 여러 개의 작은 소포를 GUV에 융합시키는 것은 본질적으로 에너지적으로 바람직하지 않으며, 따라서 하전된 지질 조성물(9) 및/또는 펩티드(19) 또는 다른 화학물질과 같은 외부 융합 유도제에서의 특이성을 필요로 한다. 한편, 에멀젼 전달 및 미세유체 방법은 각각18,20개의 이중층 형성 후 계면활성제 및 용매 제거를 통한 액적 안정화를 필요로 할 수 있다. 펄스 분사와 같은 미세유체 기술에서의 실험 셋업 및 장치의 복잡성은 추가적인 도전(21)을 부과한다. cDICE는 에멀젼 전달22,23을 지배하는 유사한 원리로부터 유래된 에멀젼-기반 방법이다. 수용액(outer solution)과 지질-오일 혼합물은 회전하는 원통형 챔버(cDICE chamber)에서 원심력에 의해 층화되어 지질 포화 계면을 형성한다. 회전하는 cDICE 챔버 내로 지질 단층 수성 액적을 떨어뜨리는 것은 액적이 외부 수용액(22,24) 내로 지질-포화 계면을 가로질러감에 따라 이중층의 지퍼링을 초래한다. cDICE 접근 방식은 GUV 캡슐화를 위한 강력한 기술입니다. 제시된 변형 방법에 의해, 상당히 짧은 캡슐화 시간(수 초)을 갖는 cDICE에 대해 전형적인 높은 소포 수율이 달성될 뿐만 아니라, 시간-의존적 과정(예를 들어, 액틴 시토골격 네트워크 형성)의 관찰을 허용하는 GUV 생성 시간이 상당히 감소된다. 이 프로토콜은 GUV 수집 및 이미징까지 처음부터 약 15-20 분이 걸립니다. 여기에서, GUV 생성은 액틴 및 액틴 결합 단백질 (ABPs)을 캡슐화하기 위한 변형된 cDICE를 사용하는 방법을 사용하여 기술된다. 그러나, 제시된 기술은 바이오폴리머의 조립에서부터 무세포 단백질 발현, 막 융합 기반 화물 전달에 이르기까지 광범위한 생물학적 반응 및 막 상호작용을 캡슐화하는데 적용가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
합성 세포의 생성을 위해 GUVs를 생성하는 다양한 방법이 탐구되었지만, 절차의 복잡성, 캡슐화를 달성하기 위한 연장된 시간, 캡슐화제의 지질 유형 및 분자 구성의 제한, 캡슐화를 용이하게 하기 위한 비생리학적 화학물질에 대한 필요성, 낮은 GUV 수율 및 캡슐화 효율의 불일치는 이 분야의 연구자들에게 계속 도전하고 있다. 상향식 합성 생물학에서 착수할 수 있는 광범위한 잠재적 연구를 고려?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL은 경험 많은 연구자를위한 훔볼트 연구 펠로우십과 국립 과학 재단 (1939310 및 1817909) 및 국립 보건원 (R01 EB030031)의 지원을 인정합니다.
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
