Rask innkapsling av rekonstituert cytoskjelett inne i gigantiske unilamellar vesicles

Summary

Denne artikkelen introduserer en enkel metode for rask produksjon av gigantiske unilamellar vesikler med innkapslede cytoskeletale proteiner. Metoden viser seg å være nyttig for nedenfra-og-opp-rekonstituering av cytoskeletale strukturer i innesperring og cytoskjelettmembraninteraksjoner.

Abstract

Giant unilamellar vesicles (GUVs) brukes ofte som modeller av biologiske membraner og er dermed et flott verktøy for å studere membranrelaterte cellulære prosesser in vitro. De siste årene har innkapsling innen GUVs vist seg å være en nyttig tilnærming for rekonstitueringsforsøk i cellebiologi og relaterte felt. Det etterligner bedre innesperringsforhold inne i levende celler, i motsetning til konvensjonell biokjemisk rekonstituering. Metoder for innkapsling i GUVer er ofte ikke enkle å implementere, og suksessrater kan variere betydelig fra lab til lab. En teknikk som har vist seg å være vellykket for å innkapsle mer komplekse proteinsystemer kalles kontinuerlig dråpegrensesnitt kryssing innkapsling (cDICE). Her presenteres en cDICE-basert metode for raskt innkapsling av cytoskeletale proteiner i GUVer med høy innkapslingseffektivitet. I denne metoden genereres først lipidmonolayerdråper ved å emulgere en proteinløsning av interesse for en lipid / oljeblanding. Etter å ha blitt lagt inn i et roterende 3D-trykt kammer, passerer disse lipid-monolagede dråpene deretter gjennom et annet lipidmonolayer ved et vann / oljegrensesnitt inne i kammeret for å danne GUVer som inneholder proteinsystemet. Denne metoden forenkler den generelle prosedyren for innkapsling i GUVer og fremskynder prosessen, og lar oss dermed begrense og observere den dynamiske utviklingen av nettverksmontering inne i lipidbilayer vesikler. Denne plattformen er nyttig for å studere mekanikken til cytoskjelettmembraninteraksjoner i innesperring.

Introduction

Lipid bilayer-rom brukes som modellsyntetiske celler for å studere lukkede organiske reaksjoner og membranbaserte prosesser eller som bæremoduler i legemiddelleveringsapplikasjoner ^1,2. Bunn-opp biologi med rensede komponenter krever minimale eksperimentelle systemer for å utforske egenskaper og interaksjoner mellom biomolekyler, som proteiner og lipider ^3,4. Men med utviklingen av feltet er det et økt behov for mer komplekse eksperimentelle systemer som bedre etterligner forholdene i biologiske celler. Innkapsling i GUVs er en praktisk tilnærming som kan tilby noen av disse cellelignende egenskapene ved å gi en deformerbar og selektivt gjennomtrengelig lipidbilayer og et begrenset reaksjonsrom. Spesielt kan in vitro rekonstituering av cytoskeletalsystemer, som modeller av syntetiske celler, dra nytte av innkapsling i membranrom⁵. Mange cytoskeletale proteiner binder og samhandler med cellemembranen. Ettersom de fleste cytoskeletale samlinger danner strukturer som spenner over hele cellen, bestemmes formen naturlig av cellestørrelsessperre⁶.

Ulike metoder brukes til å generere GUVs, for eksempel hevelse ^7,8, liten vesicle fusion ^9,10, emulsjon overføring^11,12, pulsert jetting¹³, og andre mikrofluidiske tilnærminger^14,15. Selv om disse metodene fortsatt brukes, har hver sine begrensninger. Dermed er en robust og grei tilnærming med høyt utbytte av GUV-innkapsling svært ønskelig. Selv om teknikker som spontan hevelse og elektroswelling er allment vedtatt for dannelsen av GUVer, er disse metodene først og fremst kompatible med spesifikke lipidsammensetninger¹⁶, lave saltkonsentrasjonsbuffere¹⁷, mindre innkapslet molekylær størrelse¹⁸, og krever et høyt volum av innkapslingen. Fusing flere små vesicles inn i en GUV er iboende energisk ugunstig, og krever dermed spesifisitet i ladede lipidsammensetninger⁹ og / eller eksterne fusjonsinduserende midler, for eksempel peptider¹⁹ eller andre kjemikalier. Emulsjonsoverføring og mikrofluidiske metoder kan derimot kreve dråpestabilisering gjennom overflateaktiv og fjerning av løsningsmiddel etter bilayerdannelse, henholdsvis^18,20. Kompleksiteten i eksperimentelt oppsett og enhet i mikrofluidiske teknikker som pulserende jetting pålegger en ekstra utfordring²¹. cDICE er en emulsjonsbasert metode avledet fra lignende prinsipper som regulerer emulsjonsoverføring^22,23. En vandig løsning (ytre løsning) og en lipidoljeblanding stratifiseres av sentrifugalkrefter i et roterende sylindrisk kammer (cDICE-kammer) som danner et lipidmettet grensesnitt. Shuttling lipid monolayered vandige dråper inn i roterende cDICE kammeret resulterer i zipping av en bilayer som dråper krysse lipid-mettet grensesnitt inn i den ytre vandig løsning^22,24. CDICE-tilnærmingen er en robust teknikk for GUV-innkapsling. Med den presenterte modifiserte metoden oppnås ikke bare det høye vesicleutbyttet som er typisk for cDICE med en betydelig kortere innkapslingstid (noen få sekunder), men GUV-generasjonstid som tillater observasjon av tidsavhengige prosesser (f.eks. aktin cytoskeletal nettverksdannelse) reduseres betydelig. Protokollen tar omtrent 15-20 minutter fra starten til GUV-innsamling og avbildning. Her er GUV-generasjonen beskrevet ved hjelp av den modifiserte cDICE-metoden for å innkapsle aktin- og aktinbindende proteiner (ABPer). Den presenterte teknikken gjelder imidlertid for å innkapsle et bredt spekter av biologiske reaksjoner og membraninteraksjoner, fra montering av biopolymerer til cellefritt proteinuttrykk til membranfusjonsbasert lastoverføring.

Protocol

1. Fremstilling av olje-lipidblanding MERK: Trinnet må utføres i en avtrekkshette etter alle sikkerhetsretningslinjene for håndtering av kloroform. Ta 0,5 ml kloroform i et 15 ml hetteglass med glass. Tilsett 88 μL 25 mg/ml dioleoyl-fosfokolin (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml kolesterol og 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-fosfoetanolamin-lissamin rhodamin B (rhodamin PE) (se Materialtabellen) i hetteglasset med 15 ml glass.MERK: De endelige molefraksjonene av …

Representative Results

For å demonstrere den vellykkede generasjonen av cytoskeletale GUVer ved hjelp av den nåværende protokollen, ble fascin-actinbuntstrukturer i GUVer rekonstituert. Fascin er en kort krysskobling av aktinfilamenter som danner stive parallelljusterte aktinbunter og renses fra E. coli som Glutathione-S-Transferase (GST) fusjonsprotein26. 5 μM aktin ble først rekonstituert, inkludert 0,53 μM ATTO488 aktin i aktinpolymerisasjonsbufferen og 7,5% av tetthetsgradientmediet. Ved tilsetning av…

Discussion

Ulike metoder for å generere GUVs har blitt utforsket for etablering av syntetiske celler Men kompleksiteten i prosedyrene, utvidet tid til å oppnå innkapsling, begrensning av lipidtyper og molekylær sammensetning av innkapslingen, behovet for ikke-fysiologiske kjemikalier for å lette innkapsling, lavt GUV-utbytte og inkonsekvenser i innkapslingseffektivitet har fortsatt å utfordre forskere på dette feltet. Tatt i betraktning det brede spekteret av potensielle studier som kan tas i gang i bunn-opp syntetisk biolog…

Materials

18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667