Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Yashar Bashirzadeh; Nadab Wubshet; Thomas Litschel; Petra Schwille; Allen P. Liu

doi:10.3791/63332

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

4.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/63332

⸱

10 novembre 2021

Yashar Bashirzadeh^*¹ , Nadab Wubshet^*¹ , Thomas Litschel² , Petra Schwille³ , Allen P. Liu¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ²John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, ³Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, ⁴Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode simple pour la production rapide de vésicules unilamellaires géantes avec des protéines cytosquelettiques encapsulées. La méthode s’avère utile pour la reconstitution ascendante des structures cytosquelettiques dans le confinement et les interactions cytosquelette-membrane.

Résumé

Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont fréquemment utilisées comme modèles de membranes biologiques et constituent donc un excellent outil pour étudier les processus cellulaires liés à la membrane in vitro. Ces dernières années, l’encapsulation dans les GUV s’est avérée être une approche utile pour les expériences de reconstitution en biologie cellulaire et dans des domaines connexes. Il imite mieux les conditions de confinement à l’intérieur des cellules vivantes, par opposition à la reconstitution biochimique conventionnelle. Les méthodes d’encapsulation à l’intérieur des GUV ne sont souvent pas faciles à mettre en œuvre, et les taux de réussite peuvent différer considérablement d’un laboratoire à l’autre. Une technique qui s’est avérée efficace pour encapsuler des systèmes protéiques plus complexes est appelée encapsulation croisée d’interface gouttelette continue (cDICE). Ici, une méthode basée sur cDICE est présentée pour encapsuler rapidement des protéines cytosquelettiques dans des GUV avec une efficacité d’encapsulation élevée. Dans cette méthode, tout d’abord, les gouttelettes lipido-monocouches sont générées en émulsionnant une solution protéique d’intérêt dans un mélange lipide/huile. Après avoir été ajoutées dans une chambre rotative imprimée en 3D, ces gouttelettes monocouches lipidiques passent ensuite à travers une deuxième monocouche lipidique à une interface eau/huile à l’intérieur de la chambre pour former des GUV qui contiennent le système protéique. Cette méthode simplifie la procédure globale d’encapsulation dans les GUV et accélère le processus, et nous permet ainsi de confiner et d’observer l’évolution dynamique de l’assemblage du réseau à l’intérieur des vésicules bicouches lipidiques. Cette plate-forme est pratique pour étudier la mécanique des interactions cytosquelette-membrane en confinement.

Introduction

Les compartiments bicouches lipidiques sont utilisés comme modèles de cellules synthétiques pour l’étude des réactions organiques fermées et des processus membranaires ou comme modules porteurs dans les applications d’administration^de médicaments ^1,2. La biologie ascendante avec des composants purifiés nécessite un minimum de systèmes expérimentaux pour explorer les propriétés et les interactions entre les biomolécules, telles que les protéines et les lipides ^3,4. Cependant, avec les progrès du domaine, il y a un besoin accru de systèmes expérimentaux ....