Быстрая инкапсуляция восстановленного цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул
Summary
В данной статье представлен простой метод ускоренного производства гигантских одноламеллярных везикул с инкапсулированными цитоскелетными белками. Метод оказывается полезным для восстановления цитоскелетных структур снизу вверх в конфайнменте и взаимодействиях цитоскелет-мембрана.
Abstract
Гигантские одноламеллярные везикулы (GUV) часто используются в качестве моделей биологических мембран и, таким образом, являются отличным инструментом для изучения клеточных процессов in vitro, связанных с мембраной. В последние годы инкапсуляция в ГУВ оказалась полезным подходом для экспериментов по восстановлению в клеточной биологии и смежных областях. Он лучше имитирует условия удержания внутри живых клеток, в отличие от обычного биохимического восстановления. Методы инкапсуляции внутри ГУВ часто нелегко реализовать, и показатели успеха могут значительно отличаться от лаборатории к лаборатории. Один из методов, который оказался успешным для инкапсуляции более сложных белковых систем, называется непрерывной инкапсуляцией пересечения интерфейса капель (cDICE). Здесь представлен метод на основе cDICE для быстрой инкапсуляции цитоскелетных белков в ГУВ с высокой эффективностью инкапсуляции. В этом способе, во-первых, липидно-монослойные капли получают путем эмульгирования белкового раствора, представляющего интерес, в липидно-масляной смеси. После добавления во вращающуюся 3D-печатную камеру эти липидно-монослойные капли затем проходят через второй липидный монослой на границе раздела вода/масло внутри камеры с образованием ГУВ, содержащих белковую систему. Этот метод упрощает общую процедуру инкапсуляции в ГУВ и ускоряет процесс, и, таким образом, позволяет ограничить и наблюдать динамическую эволюцию сетевой сборки внутри липидных двухслойных везикул. Эта платформа удобна для изучения механики цитоскелетно-мембранных взаимодействий в конфайнменте.
Introduction
Липидные двухслойные компартменты используются в качестве модельных синтетических клеток для изучения замкнутых органических реакций и мембранных процессов или в качестве модулей-носителей в приложениях доставки лекарств 1,2. Биология снизу вверх с очищенными компонентами требует минимальных экспериментальных систем для изучения свойств и взаимодействий между биомолекулами, такими как белки и липиды 3,4. Однако с развитием этой области возрастает потребность в более сложных экспериментальных системах, которые лучше имитируют условия в биологических клетках. Инкапсуляция в ГУВ является практическим подходом, который может предложить некоторые из этих клеточных свойств, обеспечивая деформируемый и селективно проницаемый липидный бислой и ограниченное реакционное пространство. В частности, восстановление in vitro цитоскелетных систем, как моделей синтетических клеток, может извлечь выгоду из инкапсуляции в мембранных компартментах5. Многие цитоскелетные белки связываются и взаимодействуют с клеточной мембраной. Поскольку большинство цитоскелетных сборок образуют структуры, которые охватывают всю клетку, их форма естественным образом определяется удержанием размером с клетку6.
Для генерации ГУВ используются различные методы, такие как набухание 7,8, слияние малыхпузырьков 9,10, перенос эмульсии 11,12, импульсная струя13 и другие микрофлюидные подходы 14,15. Хотя эти методы все еще используются, каждый из них имеет свои ограничения. Таким образом, очень желателен надежный и простой подход с высокой урожайностью инкапсуляции ГУВ. Хотя такие методы, как спонтанное набухание и электросвеличивание, широко распространены для образования ГУВ, эти методы в первую очередь совместимы со специфическими липидными композициями16, буферами с низкой концентрацией соли17, меньшим размером молекулы инкапсуланта18 и требуют большого объема инкапсулянта. Слияние нескольких мелких пузырьков в ГУВ по своей природе энергетически неблагоприятно, что требует специфичности в заряженных липидных композициях9 и/или внешних агентах, вызывающих слияние, таких как пептиды19 или другие химические вещества. С другой стороны, перенос эмульсии и микрофлюидные методы могут потребовать стабилизации капель путем удаления поверхностно-активного вещества и растворителя после образования бислоя, соответственно18,20. Сложность экспериментальной установки и устройства в микрофлюидных методах, таких как импульсная струйная обработка, создает дополнительную проблему21. cDICE представляет собой метод на основе эмульсии, полученный из аналогичных принципов, регулирующих перенос эмульсии 22,23. Водный раствор (наружный раствор) и липидно-масляная смесь стратифицируются центробежными силами во вращающейся цилиндрической камере (камере cDICE), образуя насыщенную липидами границу раздела. Перемещение липидных монослойных водных капель во вращающуюся камеру cDICE приводит к застегиванию бислоя, поскольку капли пересекают насыщенную липидами границу в наружный водный раствор 22,24. Подход cDICE является надежным методом инкапсуляции GUV. При представленном модифицированном способе достигается не только высокий выход пузырьков, характерный для cDICE со значительно более коротким временем инкапсуляции (несколько секунд), но и время генерации ГУВ, позволяющее наблюдать зависимые от времени процессы (например, формирование актиновых цитоскелетных сетей), значительно сокращается. Протокол занимает около 15-20 минут от начала сбора и визуализации GUV. Здесь генерация GUV описывается с использованием модифицированного метода cDICE для инкапсуляции актина и актин-связывающих белков (ABP). Однако представленный способ применим для инкапсуляции широкого спектра биологических реакций и мембранных взаимодействий, от сборки биополимеров до бесклеточной экспрессии белка и переноса груза на основе мембранного слияния.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные методы генерации ГУВ были изучены для создания синтетических клеток Однако сложность процедур, длительное время для достижения инкапсуляции, ограничение типов липидов и молекулярного состава инкапсулянта, потребность в нефизиологических химических веществах для облегчен…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL признает поддержку со стороны Исследовательской стипендии Гумбольдта для опытных исследователей и Национального научного фонда (1939310 и 1817909) и Национальных институтов здравоохранения (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimie. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimie. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
