रेस्पिरोमेट्रिक Assays के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव
Summary
यहां, हम माउस कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं और माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमितीय assays का उपयोग करके ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) द्वारा श्वसन के बाद के विश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस पाइपलाइन को माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय पर कई पर्यावरणीय या आनुवंशिक हस्तक्षेपों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
सेल की अधिकांश ऊर्जा ग्लूकोज, फैटी एसिड और अमीनो एसिड के क्षरण के माध्यम से विभिन्न मार्गों से प्राप्त की जाती है जो माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) प्रणाली पर अभिसरण करते हैं, जो सेलुलर मांगों के जवाब में विनियमित होता है। लिपिड अणु Coenzyme Q (CoQ) निरंतर ऑक्सीकरण / कमी चक्रों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) में जटिल III में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करके इस प्रक्रिया में आवश्यक है। माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिति और, अंततः, सेलुलर स्वास्थ्य का आकलन रेस्पिरोमेट्रिक एसेस का उपयोग करके ईटीसी ऑक्सीजन की खपत को मापकर किया जा सकता है। ये अध्ययन आमतौर पर स्थापित या प्राथमिक सेल लाइनों में किए जाते हैं जिन्हें कई दिनों से सुसंस्कृत किया गया है। दोनों मामलों में, प्राप्त श्वसन पैरामीटर किसी भी दिए गए अंग या ऊतक में सामान्य शारीरिक स्थितियों से विचलित हो सकते हैं।
इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों से अलग सुसंस्कृत एकल फाइबर की आंतरिक विशेषताएं इस प्रकार के विश्लेषण को बाधित करती हैं। यह पेपर माउस कंकाल की मांसपेशी से ताजा अलग माइटोकॉन्ड्रिया में श्वसन के विश्लेषण के लिए एक अद्यतन और विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हम संभावित समस्याओं के समाधान भी प्रदान करते हैं जो प्रक्रिया के किसी भी चरण में उत्पन्न हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत विधि को विविध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में ऑक्सीजन की खपत दरों की तुलना करने और दवा उपचार या उम्र बढ़ने या सेक्स जैसे अन्य कारकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स चयापचय और विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब देने के लिए एक व्यवहार्य तरीका है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया सेल 1 में प्राथमिक चयापचय ऑर्गेनेल हैं। ये विशेष झिल्ली-संलग्न ऑर्गेनेल पोषक तत्वों के अणुओं का उपयोग करते हैं ताकि OXPHOS द्वारा एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के रूप में ऊर्जा का उत्पादन किया जा सके। यह प्रक्रिया ETC2 में रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में दाता अणुओं से इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण पर निर्भर करती है। CoQ एकमात्र रेडॉक्स-सक्रिय लिपिड है जो अंतर्जात रूप से सभी सेलुलर झिल्ली और परिसंचारी लिपोप्रोटीन में उत्पादित होता है जो एंटीऑक्सिडेंट फ़ंक्शन 3 दिखाता है। यह ईटीसी का एक आवश्यक घटक है, जो एनएडीएच-निर्भर कॉम्प्लेक्स I और FADH2-निर्भर कॉम्प्लेक्स II से इलेक्ट्रॉनों को जटिल III में स्थानांतरित करता है, हालांकि कई अन्य रिडक्टेस माइटोकॉन्ड्रियल कोक्यू को कई सेलुलर चयापचय मार्गों में एक अनिवार्य कदम के रूप में यूबिक्विनॉल में कम कर सकते हैं।
इस प्रक्रिया के दौरान, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रोटॉन ग्रेडिएंट बनाया जाता है, जिसे एटीपी सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स वी 2 द्वारा जैविक रूप से सक्रिय ऊर्जा में बदल दिया जाता है। नतीजतन, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता मुख्य रूप से उच्च ऊर्जा आवश्यकताओं वाले ऊतकों को प्रभावित करने वाली रोग संबंधी स्थितियों के असंख्य की ओर ले जाती है- मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों 6,7। इसलिए, स्वास्थ्य और बीमारी में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स का सटीक विश्लेषण करने के तरीकों को विकसित करना मौलिक है, विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशियों जैसे अत्यधिक ऊर्जावान ऊतकों में।
क्लार्क-प्रकार के ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का शास्त्रीय रूप से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन 8 के अध्ययन में उपयोग किया गया है। हालांकि, इस प्रणाली को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियों द्वारा उत्तरोत्तर विस्थापित किया गया है, जिसमें माइक्रोप्लेट-आधारित ऑक्सीजन खपत प्रौद्योगिकियां जैसे कि एजाइलेंट सीहोर्स एक्सएफ विश्लेषक विशेष रूप से लोकप्रिय हैं। कंकाल की मांसपेशियों के क्षेत्र में, ये अध्ययन आमतौर पर सुसंस्कृत कोशिकाओं में आयोजित किए जाते हैं, मुख्य रूप से C2C12 अमर माउस मायोब्लास्ट सेल लाइन या उपग्रह कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्राथमिक संस्कृतियों में 10,11। हालांकि, ये अध्ययन विवो में स्थिति को पूरी तरह से याद नहीं करते हैं, खासकर जब माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान की जांच करते हैं और विशिष्ट अपमान, गैर-आनुवंशिक हस्तक्षेप, या आनुवंशिक जोड़तोड़ पर ऊतक स्तर पर कार्य करते हैं।
इसके अलावा, कोशिकाओं में श्वसन assays अतिरिक्त कारकों के कारण अधिक जटिल हैं, जिसमें एटीपी और परख सब्सट्रेट या सिग्नलिंग घटनाओं की अतिरिक्त-माइटोकॉन्ड्रियल मांग शामिल है, जो परिणामों की व्याख्या को गुमराह कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, मांसपेशियों से ताजा अलग मायोफाइबर के एकल या बंडलों का उपयोग करना भी संभव है। हालांकि, अलगाव विधि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केवल कुछ मांसपेशियों के प्रकारों के लिए संभव है। इस मामले में, फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों का उपयोग मुख्य रूप से 10,12,13 किया जाता है, हालांकि कुछ रिपोर्टों में अन्य मांसपेशियों के प्रकारों के साथ-साथ 14,15 के उपयोग का वर्णन किया गया है।
कंकाल की मांसपेशी वर्गों के bioenergetic प्रोफाइलिंग भी रिपोर्ट किया गया है16. इस विधि का प्रमुख लाभ यह है कि बरकरार मांसपेशियों का अध्ययन किया जा सकता है (लेखकों से पता चलता है कि फाइबर के माध्यम से स्लाइसिंग अलग-थलग मायोफाइबर की तुलना में परिणामों को परेशान नहीं करता है)। हालांकि, सब्सट्रेट और परख अवरोधकों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पहुंच सीमित है, और इस प्रकार, केवल कुछ मापदंडों को मापा जा सकता है16। अंत में, अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया को भी इसी तरह से नियोजित किया जा सकता है9,17,18,19। इस मामले में, माइटोकॉन्ड्रिया अपने साइटोसोलिक वातावरण को खो देता है, जो उनके कार्य को प्रभावित कर सकता है। इसके विपरीत, यह विधि सब्सट्रेट और अवरोधकों तक पहुंच की गारंटी देती है, नमूना प्रकारों की अधिकता के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, और आमतौर पर कम सामग्री की आवश्यकता होती है।
यह पेपर माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्रिक एसेस (चित्रा 1) का उपयोग करके माउस कंकाल की मांसपेशी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग को करने की एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, तीन प्रोटोकॉल विस्तृत हैं: युग्मन परख, सीए ETC और OXPHOS मशीनरी के बीच युग्मन की डिग्री का आकलन करने के लिए; इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख, ईएफए व्यक्तिगत ईटीसी परिसरों की गतिविधि को मापने के लिए; और बॉक्स परख माइटोकॉन्ड्रियल β ऑक्सीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए. विशेष रूप से, पारंपरिक श्वसनमिति विधियों की तुलना में केवल थोड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता होती है। यहां उपयोग किए जाने वाले अलगाव प्रोटोकॉल को कहीं और प्रकाशित विधि से संशोधित किया गया है18।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी तरीकों की अपनी सीमाएं हैं; इसलिए, उस विधि का चयन करना महत्वपूर्ण है जो एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए सबसे अच्छा है। यह काम माउ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Homogenizer और तकनीकी सहायता के लिए CABD प्रोटिओमिक्स और पशुपालन सुविधाओं के उपयोग के लिए जुआन जे टेना को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्पेनिश शिक्षा, संस्कृति और खेल मंत्रालय द्वारा फेलोशिप FPU16/03264 के माध्यम से J.D.H.C. के माध्यम से समर्थित किया गया था, एसोसिएशन Française contre les Myopathies (AFM) फेलोशिप अनुदान # 22450 के माध्यम से C.V.-G. को, एक संस्थागत अनुदान MDM-2016-0687 (मारिया डी Maeztu उत्कृष्टता इकाई, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग, जीन विनियमन और Mfogenesis के विभाग के लिए CABD में 80.C जुंटा डी अंडालुसिया अनुदान P18-RT-4572, यूरोपीय संघ से फेडर फंडिंग कार्यक्रम, और स्पेनिश विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों के मंत्रालय RED2018-102576-T को P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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