Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici
Summary
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l’isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.
Abstract
La maggior parte dell’energia della cellula è ottenuta attraverso la degradazione di glucosio, acidi grassi e amminoacidi da diversi percorsi che convergono sul sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS), che è regolato in risposta alle richieste cellulari. La molecola lipidica Coenzima Q (CoQ) è essenziale in questo processo trasferendo elettroni al complesso III nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) attraverso cicli di ossidazione/riduzione costanti. Lo stato dei mitocondri e, in definitiva, la salute cellulare possono essere valutati misurando il consumo di ossigeno ETC utilizzando saggi respirometrici. Questi studi vengono in genere eseguiti in linee cellulari stabilite o primarie che sono state coltivate per diversi giorni. In entrambi i casi, i parametri respiratori ottenuti possono aver deviato dalle normali condizioni fisiologiche in un dato organo o tessuto.
Inoltre, le caratteristiche intrinseche delle singole fibre coltivate isolate dal muscolo scheletrico impediscono questo tipo di analisi. Questo documento presenta un protocollo aggiornato e dettagliato per l’analisi della respirazione nei mitocondri appena isolati dal muscolo scheletrico del topo. Forniamo anche soluzioni a potenziali problemi che potrebbero sorgere in qualsiasi fase del processo. Il metodo qui presentato potrebbe essere applicato per confrontare i tassi di consumo di ossigeno in diversi modelli murini transgenici e studiare la risposta mitocondriale ai trattamenti farmacologici o ad altri fattori come l’invecchiamento o il sesso. Questo è un metodo fattibile per rispondere a domande cruciali sul metabolismo e la regolazione della bioenergetica mitocondriale.
Introduction
I mitocondri sono i principali organelli metabolici nella cellula1. Questi organelli specializzati racchiusi in membrana utilizzano molecole nutritive per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) da OXPHOS. Questo processo si basa sul trasferimento di elettroni da molecole donatrici in una serie di reazioni redox nell’ETC2. Il CoQ è l’unico lipide redox-attivo prodotto endogenamente in tutte le membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti che mostra una funzione antiossidante3. È un componente essenziale dell’ETC, trasferendo elettroni dal complesso I dipendente dal NADH e dal complesso II FADH2-dipendente al complesso III, sebbene molte altre reduttasi possano guidare la riduzione del CoQ mitocondriale all’ubichinolo come passaggio obbligatorio in più vie metaboliche cellulari4,5.
Durante tutto il processo, viene creato un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana interna mitocondriale, che viene trasformata in energia biologicamente attiva dal complesso ATP sintasi V2. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale porta a una miriade di condizioni patologiche che colpiscono principalmente i tessuti con elevato fabbisogno energetico: cervello, cuore e muscolo scheletrico6,7. Pertanto, è fondamentale sviluppare metodi per analizzare accuratamente la bioenergetica mitocondriale per indagare il suo ruolo nella salute e nella malattia, in particolare nei tessuti altamente energetici come i muscoli scheletrici.
L’elettrodo di ossigeno di tipo Clark è stato utilizzato classicamente nello studio della respirazione mitocondriale8. Tuttavia, questo sistema è stato progressivamente sostituito da tecnologie ad alta risoluzione, con tecnologie di consumo di ossigeno basate su micropiastre come gli analizzatori Agilent Seahorse XF che sono particolarmente popolari9. Nel campo del muscolo scheletrico, questi studi sono tipicamente condotti in cellule in coltura, principalmente nella linea cellulare di mioblasti di topo immortalizzati C2C12 o in colture primarie derivate da cellule satelliti10,11. Tuttavia, questi studi non ricapitolano completamente la situazione in vivo, specialmente quando si indaga la biologia mitocondriale e la funzione a livello tissutale su insulti specifici, interventi non genetici o manipolazioni genetiche.
Inoltre, i saggi respiratori nelle cellule sono più complessi a causa di fattori aggiuntivi, tra cui la domanda extra-mitocondriale di ATP e substrati di analisi o eventi di segnalazione, che potrebbero fuorviare l’interpretazione dei risultati. In alternativa, è anche possibile utilizzare singoli o fasci di miofibre appena isolate dai muscoli. Tuttavia, il metodo di isolamento è tecnicamente impegnativo e fattibile solo per alcuni tipi di muscoli. In questo caso, i muscoli flessori digitorum brevis (FDB) ed estensori digitorum longus (EDL) sono principalmente utilizzati10,12,13, anche se alcuni rapporti descrivono l’uso di altri tipi di muscoli14,15.
È stato riportato anche il profilo bioenergetico delle sezioni del muscolo scheletrico16. Il principale vantaggio di questo metodo è che i muscoli intatti possono essere studiati (gli autori dimostrano che affettare le fibre non disturba i risultati rispetto alle miofibre isolate). Tuttavia, l’accesso mitocondriale ai substrati e agli inibitori del saggio è limitato e, pertanto, è possibile misurare solo pochi parametri16. Infine, possono essere impiegati anche mitocondri isolati9,17,18,19. In questo caso, i mitocondri perdono il loro ambiente citosolico, che potrebbe influenzare la loro funzione. Al contrario, questo metodo garantisce l’accesso a substrati e inibitori, consente l’analisi di una pletora di tipi di campioni e in genere richiede meno materiale.
Questo articolo descrive un metodo per eseguire il profilo bioenergetico di mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre (Figura 1). In particolare, vengono dettagliati tre protocolli: il Coupling Assay, CA per valutare il grado di accoppiamento tra l’ETC e il macchinario OXPHOS; l’Electron Flow Assay, EFA per misurare l’attività dei singoli complessi ETC; e il test BOX per determinare la capacità di β-ossidazione mitocondriale. In particolare, sono necessarie solo piccole quantità di campioni rispetto ai metodi di respirometria convenzionali. Il protocollo di isolamento qui utilizzato è stato modificato dal metodo pubblicato altrove18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutti i metodi utilizzati per studiare la respirazione mitocondriale hanno i loro limiti; quindi, è fondamentale selezionare il metodo che meglio si adatta a una specifica domanda sperimentale. Questo lavoro fornisce un protocollo aggiornato e dettagliato per isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per eseguire diversi saggi respiratori per studiare la funzione mitocondriale. In effetti, lo studio della bioenergetica mitocondriale nei mitocondri isolati utilizzando tecnologie basate su micropiastre è prez…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare Juan J. Tena per l’uso dell’omogeneizzatore e le strutture CABD Proteomics and Animal Husbandry per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero spagnolo dell’Istruzione, della Cultura e dello Sport attraverso la borsa di studio FPU16/03264 a J.D.H.C., l’Associazione Française contre les Miopatie (AFM) attraverso la borsa di studio #22450 a C.V.-G., una sovvenzione istituzionale MDM-2016-0687 (Unità di eccellenza Maria de Maeztu, Dipartimento di regolazione genica e morfogenesi presso CABD) e BFU2017-83150-P a J.J.C. La sovvenzione della Junta de Andalucía P18-RT-4572, il programma di finanziamento FEDER dell’Unione europea e il Ministero spagnolo della scienza, dell’innovazione e delle università concedono RED2018-102576-T a P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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