Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek
Summary
Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.
Abstract
Hier rapporteren we over selectieve in vitro modellen van circuits op basis van glia (astrocyten, oligodendrocyten en microglia) en /of neuronen uit perifere (dorsale wortelganglia) en centrale weefsels (cortex, subventriculaire zone, organoïde) die dynamisch worden bestudeerd in termen van calciumverschuivingen. Het model dat is gekozen om de resultaten te illustreren is het netvlies, een eenvoudig weefsel met complexe cellulaire interacties. Calcium is een universele boodschapper die betrokken is bij de meeste belangrijke cellulaire rollen. We leggen in een stapsgewijs protocol uit hoe retinale neuron-gliacellen in cultuur kunnen worden voorbereid en geëvalueerd, waarbij calciumverschuivingen worden voorgesteld. In dit model onderscheiden we neuronen van glia op basis van hun selectieve respons op KCl en ATP. Calciumdoorlatende receptoren en kanalen worden selectief tot expressie gebracht in verschillende compartimenten. Om calciumreacties te analyseren, gebruiken we ratiometrische fluorescerende matrijzen zoals Fura-2. Deze sonde kwantificeert de vrije Ca2+ concentratie op basis van Ca2+-vrije en Ca2+-gebonden vormen, met twee verschillende pieken, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit die op twee golflengten wordt waargenomen.
Introduction
Vanwege de universele eigenschappen van calcium als tweede boodschapper, is dit ion betrokken bij een groot aantal signaleringsactiviteiten: gentranscriptie, geboorte en dood, proliferatie, migratie en differentiatie, synaptische transmissie en plasticiteit. Vandaar dat een methode die in staat is om de calciumactivatiedynamiek met getrouwheid en behendigheid te volgen, een manier zou bieden om unieke ruimtelijk-temporele reacties te observeren. Een dergelijke methode is de cellulaire calciumbeeldvormingstechniek, die calciumverschuivingen functionele gegevens correleert met specifieke celfenotypen op basis van hun verschillende reacties.
Ca2 + probes werden voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1980, met latere verbeteringen waardoor deze moleculen kunnen worden gebruikt in levende cel assays1. Als chemische indicator wordt Fura-2 beschouwd als de standaard voor kwantitatieve [Ca2+]i metingen. De acetoxymethylester (AM) van deze indicator (d.w.z. Fura-2 AM) dringt gemakkelijk door in het celmembraan en kan intracellulaire concentraties bereiken die 20 keer groter zijn dan de incubatieverdunning (bijv. [5 μM] o / [100 μM]i). Een ander voordeel van Fura-2 is dat het een goede fotobleachingweerstand heeft; het in beeld brengen van deze indicator voor langere tijd zal dus geen grote invloed hebben op de fluorescentiemogelijkheden. Ten slotte is Fura-2 gevoelig voor een breed scala aan calciumniveaus, van ~ 100 nM tot ~ 100 μM, en heeft het een Kd van ~ 145 nM, wat vergelijkbaar is met de rust [Ca2 +] i2. Later werd celcalciumbeeldvorming ontwikkeld met betere fluorescerende microscopen en berekeningsmethoden, samen met ratiometrische sondes die niet worden beïnvloed door kleurstofbelasting.
Elke cel drukt verschillende calciumapparaten uit (pompen, transporters, receptoren en kanalen) die bijdragen aan de uiteindelijke respons als een bepaalde handtekening. De belangrijke tip is om selectieve reacties van verschillende soorten cellen te vinden die gecorreleerd zijn met hun fenotypische expressie. Dienovereenkomstig zijn er ten minste twee verschillende receptoren die werken via calciumverschuivingen: ionotrope receptoren die Ca2 + in een snelle modus doordringen en langzame metabotrope receptoren gekoppeld aan signaalroutes en intracellulaire voorraden die Ca2 + vrijgeven die worden geactiveerd door tweede boodschappers, zoals inositoltrifosfaat en cyclisch ADP-ribose3.
Voorlopercellen brengen bijvoorbeeld nestine tot expressie in het onrijpe netvlies en vertonen GABAA-receptoren gedepolariseerd door GABA (of muscimol)4. Dit gebeurt als gevolg van de Cl– elektrochemische gradiënt met hoge intracellulaire Cl− niveaus; naarmate het weefsel zich ontwikkelt, schakelen KCC2-transporters over van excitatie op voorlopercellen naar remming op volwassen GABAerge neuronen5. Aan de andere kant presenteren stamcellen die sox-2 tot expressie brengen in de onrijpe subventriculaire zone (SVZ) van postnatale knaagdieren ook metabotrope H1-receptoren die worden geactiveerd door histamine die Ca2 + op een langzame manier verhoogt6. Een tweede metabotrope receptor uit de protease-geactiveerde receptor-1 (PAR-1) familie, geactiveerd door trombine en stroomafwaarts naar G(q/11) en fosfolipase C (PLC), geeft langzame Ca2+ verschuivingen in oligodendrocyten (die O4 en PLP tot expressie brengen) gegenereerd uit multipotente SVZ neurale stamcellen7.
Over het algemeen drukken neuronen spanningsafhankelijke calciumkanalen uit, evenals belangrijke neurotransmitterreceptoren die doorlaatbaar zijn voor Ca2 +, zoals glutamaterge (AMPA, NMDA, kainate) en perifere en centrale nicotinereceptoren. Kaliumchloride wordt meestal gebruikt als een depolariserend middel om perifere neuronen te activeren, zoals de dorsale wortel ganglion neuronen8 of centrale neuronen, vanaf subventriculaire zone9 of retina10. Aan de andere kant wordt ATP erkend als de belangrijkste gliotransmitter (naast D-serine), die selectieve Ca2 + permeabele P2X-leden activeert, zoals P2X7 en P2X4. Beide receptoren vertonen equivalente Ca2+-stromen, vergelijkbaar met die van NMDA-receptoren die worden erkend als de grootste Ca2+-stromen die door zenders worden geactiveerd11. P2X7-receptoren komen sterk tot expressie op microglia, maar met een lagere dichtheid op astrocyten en oligodendrocyten, die een rol spelen bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokines12. P2X7-receptoren worden ook tot expressie gebracht op Schwann-cellen13 en Müller-glia in het netvlies14,15.
Van het netvlies is bekend dat het bijna alle zenders in de hersenen laat zien. De verticale as (fotoreceptoren, bipolaire en retinale ganglioncellen) is bijvoorbeeld voornamelijk glutamaterge, met calciumdoorlatende AMPA- of kainatereceptoren uitgedrukt in OFF-bipolaire cellen en mgluR6 uitgedrukt in ON-bipolaire cellen16. Vreemd genoeg worden alle drie de receptoren ook aangetroffen in Müller glia, die zijn gekoppeld aan calcium- en inositoltrifosfaatroutes17,18. De horizontale remmende as, gemaakt door horizontale en amacrine cellen, scheidt niet alleen GABA, maar ook dopamine, acetylcholine en andere klassieke neurotransmitters. Amacrinecellen zijn de belangrijkste soorten cellen die worden aangetroffen in de aviaire retinale culturen, met verschillende soorten calciumbediende kanalen, zoals glutamaterge, purinerge, nicotine- en spanningsafhankelijke calciumkanalen. Om deze reden is dit een uitstekend model om verschillende eigenschappen van calciumverschuivingen tussen neuronen en glia te evalueren.
Daarom maakt de combinatie van verschillende receptoren en kanalen opgeteld tot selectieve fenotypische markers tijdens de ontwikkeling met verschillende agonistische responspatronen unieke handtekeningen mogelijk in stam, voorloper, neuron, astrocyten, oligodendrocyten en microglia die werken via selectieve signaleringsapparaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben het netvliesweefsel gebruikt om aan te tonen dat calciumresponsen gemedieerd door KCl of ATP duidelijk zijn gecompartimenteerd in respectievelijk neuronale en gliale responsen (figuur 1). Hoewel sommige gegevens in de literatuur impliceren dat P2X7-receptoren tot expressie komen in neuronen, die neuronale activiteit en synaptische neurotransmitterafgifte reguleren20, betwijfelen andere auteurs het bestaan van neuronale P2X7-receptoren. Inderdaad, de huidige …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Beurzen, sponsors en financieringsbronnen: MH is ontvanger van een PhD CNPq-beurs. HRF ontvangt een postdoc fellowship ondersteund door CNPq (HRF grant number 152071/2020-2). RAMR wordt ondersteund door CNPq en FAPERJ (subsidienummers E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 en 312157/2016-9 en INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neurosciences. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
