Visualiser les changements sur le circuit neurone-glie avec la technique d’imagerie calcique

Summary

L’imagerie calcique cellulaire est une méthodologie polyvalente pour étudier la signalisation dynamique de cellules individuelles, sur des populations mixtes en culture ou même sur des animaux éveillés, basée sur l’expression de canaux /récepteurs perméables au calcium qui donne des signatures fonctionnelles uniques.

Abstract

Ici, nous rapportons des modèles sélectifs in vitro de circuits basés sur la glie (astrocytes, oligodendrocytes et microglies) et / ou les neurones des tissus périphériques (ganglions de la racine dorsale) et centraux (cortex, zone sous-ventriculaire, organoïde) qui sont étudiés dynamiquement en termes de changements calciques. Le modèle choisi pour illustrer les résultats est la rétine, un tissu simple aux interactions cellulaires complexes. Le calcium est un messager universel impliqué dans la plupart des rôles cellulaires importants. Nous expliquons dans un protocole étape par étape comment les cellules neuronales-gliales rétiniennes en culture peuvent être préparées et évaluées, en envisageant des changements de calcium. Dans ce modèle, nous différencions les neurones de la glie en fonction de leur réponse sélective au KCl et à l’ATP. Les récepteurs et les canaux perméables au calcium sont exprimés sélectivement dans différents compartiments. Pour analyser les réponses calciques, nous utilisons des matrices fluorescentes ratiométriques telles que Fura-2. Cette sonde quantifie la concentration de ^Ca2+ libre sur la base de formes sans ^Ca2+ et liées à ^Ca2+, présentant deux pics différents, fondés sur l’intensité de fluorescence perçue sur deux longueurs d’onde.

Introduction

En raison des propriétés universelles du calcium en tant que deuxième messager, cet ion est impliqué dans un grand nombre d’activités de signalisation: transcription des gènes, naissance et mort, prolifération, migration et différenciation, transmission synaptique et plasticité. Par conséquent, une méthode capable de suivre la dynamique d’activation du calcium avec fidélité et agilité fournirait un moyen d’observer des réponses spatio-temporelles uniques. Une telle méthode est la technique d’imagerie cellulaire du calcium, qui met en corrélation les données fonctionnelles des décalages calciques avec des phénotypes cellulaires spécifiques en fonction de leurs réponses....

Protocol

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées et réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université fédérale de Rio de Janeiro, conformément aux « Principes de soins aux animaux de laboratoire » (NIH, Bethesda, États-Unis); numéro de permis IBCCF-035 pour les œufs de poule fécondés de Livourne blanche.

1. Préparation des solutions

1. Préparer la solution de Krebs : (132 mM naCl, 4 mM KCl, 1,4 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 6 mM de glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
2. Préparer un tampon salin (solution san....

Results

Ici, nous avons utilisé des cellules de rétine en culture à partir de poussins embryonnaires de jour 8 pour étudier comment les neurones et le signal glie en termes de changement de calcium. Les cultures ont été préparées essentiellement comme ^décrit15,19 comme des cellules mixtes neurones-gliales (à une densité de ≥ 1 x ¹⁰⁶ cellules/plat) à un stade de 7 jours in vitro (Figure 1A). Alternativement, des cellules neuronales.......

Discussion

Nous avons utilisé le tissu rétinien pour montrer que les réponses calciques médiées par le KCl ou l’ATP sont clairement compartimentées en réponses neuronales et gliales, respectivement (Figure 1). Bien que certaines données dans la littérature impliquent que les récepteurs P2X7 sont exprimés dans les neurones, qui régulent l’activité neuronale et la libération de neurotransmetteurs ^{synaptiques20}, d’autres auteurs remettent en question l’existence de récepteurs P2X7 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lamelle de recouvrement de 15 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Support de cellule
Filtre passe-long 510 nm	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplément	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP numérique appareil photo	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Milieu de culture cellulaire
Logiciel Excel Microsoft
Fetal Calf	Serum Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescence	Microscope Axiovert 200 ; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Sondes moléculaires	F1221	Indicateur ratiométrique Ca2+
Sulfate de gentamicine	Calbiochem	1405-41-0	antibiotiques
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 appareil	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Aide à l’adhésion cellulaire
Logiciel Metafluor	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
Plate-forme PH3	Warner Intruments, Hamden, CT	64-0286
Sondes moléculaires	Pluronic F-127	P6866	non ionique, tensioactif
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Aide à l’adhésion cellulaire
Trypsine-EDTA 0,25 %	Gibco	25200056	Enzyme de dissociation