חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי
Summary
פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.
Abstract
אגרגטים תאיים תלת-ממדיים (3D), המכונים ספרואידים, הפכו בשנים האחרונות לחזית תרבית התאים במבחנה . בניגוד לתאי התרבות כחד-שכבתיים דו-ממדיים חד-תאיים (תרבית דו-ממדית), תרבית תאים כדורית מקדמת, מווסתת ותומכת בארכיטקטורה תאית פיזיולוגית ובמאפיינים הקיימים ב-vivo, כולל ביטוי של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, איתות תאים, ביטוי גנים, ייצור חלבונים, התמיינות והתפשטות. חשיבותה של תרבית תלת-ממדית הוכרה בתחומי מחקר רבים, כולל אונקולוגיה, סוכרת, ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות. בעשור האחרון פותחו שיטות משופרות לייצור ספרואידים ולהערכת תפקודם המטבולי וגורלם.
מנתחי שטף חוץ-תאי (XF) שימשו כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה במיקרוטיסים תלת-ממדיים כגון ספרואידים באמצעות צלחת לכידת איים XF24 או מיקרו-פלטה ספרואידית XFe96. עם זאת, פרוטוקולים ברורים ואופטימיזציה של בדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF לא תוארו בפירוט. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות מיקרו-פלטות ספרואידיות עם מנתח XF XFe96. באמצעות קווי תאים סרטניים שונים, טכנולוגיית XF מוכחת כמי שמסוגלת להבחין בין נשימה תאית בספרואידים תלת-ממדיים בגדלים שונים לא רק בגדלים שונים, אלא גם בנפחים שונים, מספרי תאים, תכולת DNA וסוגים שונים.
ריכוזי התרכובת האופטימליים של אוליגומיצין, BAM15, רוטנון ואנטימיצין A משמשים לבדיקת פרמטרים ספציפיים של חילוף חומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים תלת-ממדיים. מאמר זה דן גם בשיטות לנרמול נתונים המתקבלים מספרואידים ומתייחס לשיקולים רבים שיש לקחת בחשבון בעת חקירת חילוף החומרים של הספרואידים באמצעות טכנולוגיית XF. פרוטוקול זה יסייע להניע מחקר במודלים מתקדמים של ספרואידים במבחנה .
Introduction
ההתקדמות במודלים חוץ גופיים במחקר הביולוגי התקדמה במהירות במהלך 20 השנים האחרונות. מודלים כאלה כוללים כיום אופנות של איברים על שבב, אורגנואידים וספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה, שכולם הפכו למוקד נפוץ לשיפור התרגום בין מחקרי in vitro ו-in vivo. השימוש במודלים מתקדמים במבחנה, במיוחד ספרואידים, משתרע על פני מספר תחומי מחקר, כולל הנדסת רקמות, מחקר בתאי גזע, סרטן וביולוגיה של מחלות 1,2,3,4,5,6,7, ובדיקות בטיחות, כולל טוקסיקולוגיה גנטית 8,9,10, טוקסיקולוגיה של ננו-חומרים11, 12,13,14, ובדיקות בטיחות ויעילות של תרופות 8,15,16,17,18,19.
מורפולוגיה תקינה של תאים היא קריטית לפנוטיפ ולפעילות ביולוגית. גידול תאים לכדי ספרואידים תלת-ממדיים של מיקרוטיסואה מאפשר לתאים לאמץ מורפולוגיה, פונקציה פנוטיפית וארכיטקטורה, הדומים יותר לאלה שנצפו in vivo אך קשים ללכידה באמצעות טכניקות קלאסיות של תרביות תאים חד-שכבתיות יותר. הן in vivo והן in vitro, תפקוד התאים מושפע ישירות מהמיקרו-סביבה התאית, שאינה מוגבלת לתקשורת תאית ותכנות (למשל, תצורות צומת תאים-תאים, הזדמנויות ליצור נישות תאים); חשיפת תאים להורמונים ולגורמי גדילה בסביבות המיידיות (למשל, חשיפה לציטוקין תאי כחלק מתגובה דלקתית); הרכב של מטריצות פיזיקליות וכימיות (למשל, האם תאים גדלים בפלסטיק בתרבית רקמה נוקשה או בסביבת רקמה אלסטית); והכי חשוב, כיצד חילוף החומרים התאי מושפע מתזונה וגישה לחמצן, כמו גם מעיבוד של תוצרי פסולת מטבולית כגון חומצה לקטית.
ניתוח שטף מטבולי הוא דרך רבת עוצמה לבחון את חילוף החומרים התאי בתוך מערכות מוגדרות במבחנה . באופן ספציפי, טכנולוגיית XF מאפשרת ניתוח של שינויים חיים בזמן אמת בביו-אנרגיה תאית של תאים ורקמות שלמים. בהתחשב בכך שאירועים מטבוליים תוך-תאיים רבים מתרחשים בסדר גודל של שניות עד דקות, גישות תפקודיות בזמן אמת הן בעלות חשיבות עליונה להבנת שינויים בזמן אמת בשטף המטבולי התאי בתאים שלמים וברקמות במבחנה.
מאמר זה מספק פרוטוקולים לטיפוח קווי תאים שמקורם בסרטן A549 (אדנוקרצינומה של הריאות), HepG2/C3A (קרצינומה הפטוצלולרית), MCF-7 (אדנוקרצינומה של השד) ו-SK-OV-3 (אדנוקרצינומה שחלתית) כמו במודלים ספרואידיים תלת-ממדיים במבחנה תוך שימוש בגישות של צבירה כפויה (איור 1). הוא גם (i) מתאר בפירוט כיצד לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות תלת-ממדיות בודדות באמצעות מנתח Agilent XFe96 XF, (ii) מדגיש דרכים לייעל את מבחני ה-XF באמצעות ספרואידים תלת-ממדיים בודדים, ו-(iii) דן בשיקולים חשובים ובמגבלות של בדיקת חילוף החומרים הספרואידי התלת-ממדי באמצעות גישה זו. והכי חשוב, מאמר זה מתאר כיצד נאספים מערכי נתונים המאפשרים חישוב של קצב צריכת החמצן (OCR) כדי לקבוע זרחון חמצוני ובכך את תפקוד המיטוכונדריה בספרואידים תאיים. למרות שלא נותח עבור פרוטוקול זה, קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) הוא פרמטר נוסף הנמדד לצד נתוני OCR בניסויי XF. עם זאת, ECAR מתפרש לעתים קרובות בצורה גרועה או שגויה ממערכי נתונים של XF. אנו מספקים פרשנות לגבי המגבלות של חישוב ECAR בעקבות גישות בסיסיות של יצרן הטכנולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ממצאים ותפוקות עיקריים
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבדיקת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של ספרואידים תלת-ממדיים בודדים באמצעות סדרה של קווי תאים שמקורם בסרטן עם מנתח XFe96 XF. שיטה מפותחת ומתוארת לטיפוח מהיר של A549, HepG2/C3A, MCF7 ו-SK-OV-3 כדוריים תאיים באמצעות טכנולוגיות דוחות תא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C נתמך על ידי פרס מקרה BBSRC MIBTP עם Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
References
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511 (2014).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109 (2018).
- Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74 (2019).
- Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
- Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548 (2019).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2020).
- Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
- Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
- Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22 (2019).
- Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545 (2020).
- Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
- Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279 (2020).
- Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071 (2020).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
- Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
- Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397 (2020).
- Chen, S. -. Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism – Clinical and Experimental. 117, 154724 (2021).
- Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178 (2021).
- Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
- Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
- Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
- Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
- Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673 (2021).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
- Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863 (2019).
- vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
- Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
- Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312 (2015).
- Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076 (2019).
- Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
- Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
- Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
- Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208 (2015).
- Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434 (2016).
- Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
- Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192 (2020).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
- Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938 (2018).
- Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).
