Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse
Summary
Diese Protokolle werden den Benutzern helfen, den mitochondrialen Energiestoffwechsel in 3D-Krebszelllinien-abgeleiteten Sphäroiden mithilfe der extrazellulären Flussanalyse von Seepferdchen zu untersuchen.
Abstract
Dreidimensionale (3D) zelluläre Aggregate, sogenannte Sphäroide, sind in den letzten Jahren an die Spitze der In-vitro-Zellkultur gerückt. Im Gegensatz zur Kultivierung von Zellen als zweidimensionale, einzellige Monoschichten (2D-Kultur) fördert, reguliert und unterstützt die sphäroide Zellkultur die physiologische Zellarchitektur und -merkmale, die in vivo existieren, einschließlich der Expression extrazellulärer Matrixproteine, Zellsignalisierung, Genexpression, Proteinproduktion, Differenzierung und Proliferation. Die Bedeutung der 3D-Kultur wurde in vielen Forschungsbereichen anerkannt, darunter Onkologie, Diabetes, Stammzellbiologie und Tissue Engineering. In den letzten zehn Jahren wurden verbesserte Methoden entwickelt, um Sphäroide herzustellen und ihre Stoffwechselfunktion und ihr Schicksal zu beurteilen.
Extrazelluläre Flussanalysatoren (XF) wurden verwendet, um die mitochondriale Funktion in 3D-Mikrogeweben wie Sphäroiden zu untersuchen, wobei entweder eine XF24-Insel-Capture-Platte oder eine XFe96-Sphäroid-Mikroplatte verwendet wurden. Unterschiedliche Protokolle und die Optimierung des mitochondrialen Energiestoffwechsels in Sphäroiden unter Verwendung der XF-Technologie wurden jedoch nicht im Detail beschrieben. Dieses Dokument enthält detaillierte Protokolle zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels in einzelnen 3D-Sphäroiden unter Verwendung von Sphäroid-Mikrotiterplatten mit dem XFe96 XF-Analysator. Unter Verwendung verschiedener Krebszelllinien kann die XF-Technologie nachweislich zwischen der Zellatmung in 3D-Sphäroiden nicht nur unterschiedlicher Größe, sondern auch unterschiedlicher Volumina, Zellnummern, DNA-Gehalt und -Typ unterscheiden.
Die optimalen mitochondrialen Effektorverbindungskonzentrationen von Oligomycin, BAM15, Rotenon und Antimycin A werden verwendet, um spezifische Parameter des mitochondrialen Energiestoffwechsels in 3D-Sphäroiden zu untersuchen. Dieses Papier diskutiert auch Methoden zur Normalisierung von Daten, die von Sphäroiden erhalten wurden, und befasst sich mit vielen Überlegungen, die bei der Erforschung des Sphäroidstoffwechsels mit der XF-Technologie berücksichtigt werden sollten. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die Forschung in fortschrittlichen In-vitro-Sphäroidmodellen voranzutreiben.
Introduction
Fortschritte bei In-vitro-Modellen in der biologischen Forschung haben in den letzten 20 Jahren rasante Fortschritte gemacht. Solche Modelle umfassen nun Organ-on-a-Chip-Modalitäten, Organoide und 3D-Mikrogewebe-Sphäroide, die alle zu einem gemeinsamen Schwerpunkt geworden sind, um die Translation zwischen In-vitro- und In-vivo-Studien zu verbessern. Die Verwendung fortschrittlicher In-vitro-Modelle, insbesondere von Sphäroiden, umfasst mehrere Forschungsbereiche, darunter Tissue Engineering, Stammzellforschung, Krebs und Krankheitsbiologie 1,2,3,4,5,6,7 und Sicherheitstests, einschließlich genetischer Toxikologie 8,9,10, Nanomaterial-Toxikologie 11, 12,13,14 und Arzneimittelsicherheits- und Wirksamkeitsprüfung 8,15,16,17,18,19.
Die normale Zellmorphologie ist entscheidend für den biologischen Phänotyp und die biologische Aktivität. Die Kultivierung von Zellen zu 3D-Mikrogewebe-Sphäroiden ermöglicht es Zellen, eine Morphologie, phänotypische Funktion und Architektur anzunehmen, die eher der in vivo beobachteten ähnelt, aber mit klassischen Monolayer-Zellkulturtechniken schwer einzufangen ist. Sowohl in vivo als auch in vitro wird die zelluläre Funktion direkt von der zellulären Mikroumgebung beeinflusst, die nicht auf die zelluläre Kommunikation und Programmierung beschränkt ist (z. B. Zell-Zell-Verbindungsbildungen, Möglichkeiten zur Bildung von Zellnischen); Zellexposition gegenüber Hormonen und Wachstumsfaktoren in der unmittelbaren Umgebung (z. B. zelluläre Zytokin-Exposition als Teil einer Entzündungsreaktion); Zusammensetzung physikalischer und chemischer Matrizen (z. B. ob Zellen in einer steifen Gewebekulturplastik oder einer elastischen Gewebeumgebung gezüchtet werden); und vor allem, wie der Zellstoffwechsel durch die Ernährung und den Zugang zu Sauerstoff sowie die Verarbeitung von Stoffwechselabfallprodukten wie Milchsäure beeinflusst wird.
Die metabolische Flussanalyse ist eine leistungsstarke Möglichkeit, den Zellstoffwechsel innerhalb definierter In-vitro-Systeme zu untersuchen. Insbesondere ermöglicht die XF-Technologie die Analyse von Live-Echtzeit-Veränderungen in der zellulären Bioenergetik intakter Zellen und Gewebe. Angesichts der Tatsache, dass viele intrazelluläre Stoffwechselereignisse in der Größenordnung von Sekunden bis Minuten auftreten, sind funktionelle Ansätze in Echtzeit von größter Bedeutung, um Echtzeitänderungen des zellulären Stoffwechselflusses in intakten Zellen und Geweben in vitro zu verstehen.
Dieses Papier enthält Protokolle für die Kultivierung von Krebs-abgeleiteten Zelllinien A549 (Lungen-Adenokarzinom), HepG2 / C3A (hepatozelluläres Karzinom), MCF-7 (Brust-Adenokarzinom) und SK-OV-3 (ovarielles Adenokarzinom) als In-vitro-3D-Sphäroidmodelle unter Verwendung von erzwungenen Aggregationsansätzen (Abbildung 1). Es beschreibt auch (i) detailliert, wie der mitochondriale Energiestoffwechsel einzelner 3D-Sphäroide mit dem Agilent XFe96 XF-Analysator untersucht werden kann, (ii) zeigt Möglichkeiten zur Optimierung von XF-Assays mit einzelnen 3D-Sphäroiden auf und (iii) diskutiert wichtige Überlegungen und Einschränkungen der Untersuchung des 3D-Sphäroidstoffwechsels mit diesem Ansatz. Am wichtigsten ist, dass dieses Papier beschreibt, wie Datensätze gesammelt werden, die die Berechnung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ermöglichen, um die oxidative Phosphorylierung und damit die mitochondriale Funktion in zellulären Sphäroiden zu bestimmen. Obwohl nicht für dieses Protokoll analysiert, ist die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) ein weiterer Parameter, der neben OCR-Daten in XF-Experimenten gemessen wird. ECAR wird jedoch oft schlecht oder falsch aus XF-Datensätzen interpretiert. Wir kommentieren die Grenzen der Berechnung von ECAR nach grundlegenden Ansätzen des Technologieherstellers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtigste Ergebnisse und Ergebnisse
Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Sphäroide unter Verwendung einer Reihe von Krebszelllinien mit dem XFe96 XF Analyzer. Es wird ein Verfahren zur schnellen Kultivierung von A549, HepG2/C3A, MCF7 und SK-OV-3 zellulären Sphäroiden unter Verwendung von zellabweisenden Technologien zur erzwungenen Aggregation entwickelt und beschrieben. Dieses Protokoll befasst sich mit vielen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C wurde durch einen BBSRC MIBTP CASE Award mit Sygnature Discovery Ltd unterstützt (BB/M01116X/1, 1940003)
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
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