JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Recherche en cancérologie

Utforske mitokondriell energimetabolisme av enkelt 3D microtissue sfæroider ved hjelp av ekstracellulær fluksanalyse

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63346
, , , ,
1School of Biosciences,University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy,University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre,University of Birmingham

Summary

Disse protokollene vil hjelpe brukerne med å undersøke mitokondriell energimetabolisme i 3D-kreftcellelinjeavledede sfæroider ved hjelp av Seahorse ekstracellulær fluksanalyse.

Abstract

Tredimensjonale (3D) cellulære aggregater, kalt sfæroider, har blitt forkant av in vitro cellekultur de siste årene. I motsetning til dyrking av celler som todimensjonale, encellede monolag (2D-kultur), fremmer, regulerer og støtter sfæroidcellekultur fysiologisk cellulær arkitektur og egenskaper som eksisterer in vivo, inkludert uttrykk for ekstracellulære matriksproteiner, cellesignalering, genuttrykk, proteinproduksjon, differensiering og proliferasjon. Betydningen av 3D-kultur har blitt anerkjent i mange forskningsfelt, inkludert onkologi, diabetes, stamcellebiologi og vevsteknikk. I løpet av det siste tiåret har forbedrede metoder blitt utviklet for å produsere sfæroider og vurdere deres metabolske funksjon og skjebne.

Ekstracellulære fluksanalysatorer (XF) har blitt brukt til å utforske mitokondriell funksjon i 3D-mikrotissuer som sfæroider ved hjelp av enten en XF24-holmefangplate eller en XFe96 sfæroid mikroplate. Imidlertid er forskjellige protokoller og optimalisering av probing mitokondriell energimetabolisme i sfæroider ved bruk av XF-teknologi ikke beskrevet i detalj. Dette papiret gir detaljerte protokoller for sondering av mitokondriell energimetabolisme i enkle 3D-sfæroider ved bruk av sfæroidmikroplater med XFe96 XF-analysatoren. Ved hjelp av forskjellige kreftcellelinjer demonstreres XF-teknologi å være i stand til å skille mellom cellulær respirasjon i 3D-sfæroider av ikke bare forskjellige størrelser, men også forskjellige volumer, celletall, DNA-innhold og type.

De optimale mitokondrielle effektorkonsentrasjonene av oligomycin, BAM15, rotenon og antimycin A brukes til å undersøke spesifikke parametere for mitokondriell energimetabolisme i 3D-sfæroider. Dette papiret diskuterer også metoder for å normalisere data hentet fra sfæroider og adresserer mange hensyn som bør vurderes når man utforsker sfæroid metabolisme ved hjelp av XF-teknologi. Denne protokollen vil bidra til å drive forskning i avanserte in vitro sfæroidmodeller.

Introduction

Fremskritt i in vitro-modeller innen biologisk forskning har utviklet seg raskt de siste 20 årene. Slike modeller inkluderer nå organ-on-a-chip-modaliteter, organoider og 3D mikrotissue-sfæroider, som alle har blitt et felles fokus for å forbedre oversettelsen mellom in vitro og in vivo studier. Bruken av avanserte in vitro-modeller, spesielt sfæroider, spenner over flere forskningsfelt, inkludert vevsteknikk, stamcelleforskning, kreft og sykdomsbiologi 1,2,3,4,5,6,7 og sikkerhetstesting, inkludert genetisk toksikologi 8,9,10, nanomaterialer toksikologi11, 12,13,14, og legemiddelsikkerhet og effekt testing 8,15,16,17,18,19.

Normal cellemorfologi er kritisk for biologisk fenotype og aktivitet. Dyrking av celler i 3D mikrotissue sfæroider tillater celler å vedta en morfologi, fenotypisk funksjon og arkitektur, mer lik den som observeres in vivo , men vanskelig å fange med klassiske monolagscellekulturteknikker. Både in vivo og in vitro påvirkes cellulær funksjon direkte av det cellulære mikromiljøet, som ikke er begrenset til cellulær kommunikasjon og programmering (f.eks. Celle-celle-kryssformasjoner, muligheter til å danne cellenisjer); celleeksponering for hormoner og vekstfaktorer i nærmiljøet (f.eks. cellulær cytokineksponering som en del av en inflammatorisk respons); sammensetning av fysiske og kjemiske matriser (f.eks. om celler dyrkes i stivvevskulturplast eller et elastisk vevsmiljø); og viktigst av alt, hvordan cellulær metabolisme påvirkes av ernæring og tilgang til oksygen, samt behandling av metabolske avfallsprodukter som melkesyre.

Metabolsk fluksanalyse er en kraftig måte å undersøke cellulær metabolisme innenfor definerte in vitro-systemer . Spesielt tillater XF-teknologi analyse av levende, sanntidsendringer i cellulær bioenergetikk av intakte celler og vev. Gitt at mange intracellulære metabolske hendelser forekommer i løpet av sekunder til minutter, er funksjonelle tilnærminger i sanntid avgjørende for å forstå sanntidsendringer i cellulær metabolsk fluks i intakte celler og vev in vitro.

Dette papiret gir protokoller for dyrking av kreftavledede cellelinjer A549 (lungeadenokarsinom), HepG2 / C3A (hepatocellulært karsinom), MCF-7 (brystadenokarsinom) og SK-OV-3 (ovarieadenokarsinom) som in vitro 3D-sfæroidmodeller ved bruk av tvungen aggregeringsmetoder (figur 1). Den beskriver også (i) i detalj hvordan man undersøker mitokondriell energimetabolisme av enkle 3D-sfæroider ved hjelp av Agilent XFe96 XF-analysatoren, (ii) fremhever måter å optimalisere XF-analyser ved hjelp av enkle 3D-sfæroider, og (iii) diskuterer viktige hensyn og begrensninger ved å undersøke 3D-sfæroid metabolisme ved hjelp av denne tilnærmingen. Viktigst beskriver dette papiret hvordan datasett samles inn som tillater beregning av oksygenforbrukshastighet (OCR) for å bestemme oksidativ fosforylering og dermed mitokondriell funksjon i cellulære sfæroider. Selv om det ikke er analysert for denne protokollen, er ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) en annen parameter som måles sammen med OCR-data i XF-eksperimenter. Imidlertid tolkes ECAR ofte dårlig eller feil fra XF-datasett. Vi gir en kommentar til begrensningene ved beregning av ECAR etter grunnleggende tilnærminger fra teknologiprodusenten.

Protocol

Figur 1: Grafisk arbeidsflyt for generering av cellulære sfæroider, ekstracellulær fluksanalyse og nedstrøms analyser. Fire kreftcellelinjer ble selektivt dyrket som monolag (A), løsrevet fra vevskulturflasker og sådd til ultralav vedlegg 96-brønn mikroplater for å danne sfæroider (B). A549 lungekarsinom, H…

Representative Results

For å oppnå velformede, kompakte sfæroider ble hver cellelinje optimalisert individuelt for såtetthet og varighet av dyrking (figur 3). A549, HepG2 /C3A og SK-OV-3 cellelinjer dannet opprinnelig løse aggregater som ikke utviklet seg til runde sfæroider med klart definerte omkretser før etter 7 dager i kultur. Omvendt kan MCF-7-celler danne sfæroider innen 3 dager. Det var en klar sammenheng mellom initial cellesåingstetthet og sfæroidvolum etter dyrkningsperioden for alle sfæroidm…

Discussion

Hovedfunn og resultater
Dette papiret gir en detaljert protokoll for å undersøke mitokondriell energimetabolisme av enkle 3D-sfæroider ved hjelp av en serie kreftavledede cellelinjer med XFe96 XF Analyzer. En metode er utviklet og beskrevet for rask dyrking av A549, HepG2 / C3A, MCF7 og SK-OV-3 cellulære sfæroider ved bruk av celleavvisende teknologier for tvungen aggregering. Denne protokollen adresserer mange hensyn ved sondering av sfæroid metabolisme med XF-teknologi, inkludert (1) optimalis…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.J.C ble støttet av en BBSRC MIBTP CASE Award med Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Materials

A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. – Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. –
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511 (2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109 (2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74 (2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548 (2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22 (2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545 (2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279 (2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071 (2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397 (2020).
  26. Chen, S. -. Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism – Clinical and Experimental. 117, 154724 (2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178 (2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673 (2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863 (2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312 (2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076 (2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208 (2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434 (2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192 (2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938 (2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Tags

Mitochondrial Energy MetabolismExtracellular Flux AnalysisCell LinesCell NumbersPhenotypesDrug TreatmentsDrug DiscoveryRecherche en cancérologieIn Vitro SpheroidsSpheroid ViabilitySensor CartridgeCalibrantAssay KitPoly-D-LysineXF RPMI Medium
check_url/fr/63346?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image