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Recherche en cancérologie

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63346
, , , ,
1School of Biosciences,University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy,University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre,University of Birmingham

Summary

Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.

Abstract

Agregados celulares tridimensionais (3D), denominados esferoides, tornaram-se a vanguarda da cultura celular in vitro nos últimos anos. Em contraste com as células cultivadas como monocamadas bidimensionais e unicelulares (cultura 2D), a cultura celular esfóide promove, regula e suporta arquitetura fisiológica celular e características que existem in vivo, incluindo a expressão de proteínas de matriz extracelular, sinalização celular, expressão genética, produção de proteínas, diferenciação e proliferação. A importância da cultura 3D tem sido reconhecida em muitas áreas de pesquisa, incluindo oncologia, diabetes, biologia de células-tronco e engenharia de tecidos. Na última década, métodos aprimorados foram desenvolvidos para produzir esferoides e avaliar sua função metabólica e destino.

Analisadores de fluxo extracelular (XF) têm sido usados para explorar a função mitocondrial em microtissues 3D, como esferoides usando uma placa de captura de ilhotas XF24 ou uma microplaca esferoide XFe96. No entanto, protocolos distintos e a otimização da sondagem do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides usando a tecnologia XF não foram descritos em detalhes. Este artigo fornece protocolos detalhados para sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D únicos usando microplapes esferoides com o analisador XFe96 XF. Usando diferentes linhas de células cancerígenas, a tecnologia XF é demonstrada ser capaz de distinguir entre a respiração celular em esferoides 3D não apenas de tamanhos diferentes, mas também diferentes volumes, números celulares, conteúdo de DNA e tipo.

As concentrações compostas de efeito mitocondrial ideal de oligomicina, BAM15, rotenona e antimicina A são usadas para sondar parâmetros específicos do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D. Este artigo também discute métodos para normalizar dados obtidos a partir de esferoides e aborda muitas considerações que devem ser consideradas ao explorar o metabolismo esferoide usando a tecnologia XF. Este protocolo ajudará a impulsionar a pesquisa em modelos esferoides in vitro avançados.

Introduction

Os avanços em modelos in vitro em pesquisa biológica progrediram rapidamente nos últimos 20 anos. Tais modelos agora incluem modalidades organ-on-a-chip, organoides e esferoides microtissue 3D, todos os quais se tornaram um foco comum para melhorar a tradução entre estudos in vitro e in vivo. O uso de modelos in vitro avançados, particularmente esferoides, abrange diversos campos de pesquisa, incluindo engenharia de tecidos, pesquisa de células-tronco, câncer e biologia de doenças 1,2,3,4,5,6,7, e testes de segurança, incluindo toxicologia genética 8,9,10, toxicologia de nanomateriais11, 12,13,14, e testes de segurança e eficácia de medicamentos 8,15,16,17,18,19.

A morfologia celular normal é fundamental para o fenótipo biológico e a atividade. A colheita de células em esferoides microtissue 3D permite que as células adotem uma morfologia, função fenotípica e arquitetura, mais semelhantes às observadas in vivo , mas difíceis de capturar com técnicas clássicas de cultura celular monocamada. Tanto in vivo quanto in vitro, a função celular é diretamente impactada pelo microambiente celular, que não se limita à comunicação e programação celular (por exemplo, formações de junção celular-célula, oportunidades de formação de nichos celulares); exposição celular a hormônios e fatores de crescimento nos ambientes imediatos (por exemplo, exposição à citocina celular como parte de uma resposta inflamatória); composição de matrizes físicas e químicas (por exemplo, se as células são cultivadas em plástico de cultura tecidual rígida ou um ambiente de tecido elástico); e, mais importante, como o metabolismo celular é impactado pela nutrição e acesso ao oxigênio, bem como pelo processamento de resíduos metabólicos, como o ácido láctico.

A análise do fluxo metabólico é uma maneira poderosa de examinar o metabolismo celular dentro de sistemas in vitro definidos. Especificamente, a tecnologia XF permite a análise de mudanças ao vivo e em tempo real nos bioenergésicos celulares de células e tecidos intactos. Dado que muitos eventos metabólicos intracelulares ocorrem dentro da ordem de segundos a minutos, abordagens funcionais em tempo real são primordiais para entender mudanças em tempo real no fluxo metabólico celular em células intactas e tecidos in vitro.

Este artigo fornece protocolos para o cultivo das linhas celulares derivadas do câncer A549 (adenocarcinoma pulmonar), HepG2/C3A (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma mamário) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovariano) como modelos esferoides in vitro 3D usando abordagens de agregação forçada (Figura 1). Ele também (i) descreve em detalhes como sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando o analisador Agilent XFe96 XF, (ii) destaca maneiras de otimizar os ensaios XF usando spheroids 3D únicos, e (iii) discute considerações e limitações importantes de sondagem do metabolismo esferoide 3D usando essa abordagem. Mais importante, este artigo descreve como são coletados conjuntos de dados que permitem o cálculo da taxa de consumo de oxigênio (OCR) para determinar a fosforilação oxidativa e, portanto, a função mitocondrial em esferoides celulares. Embora não seja analisada para este protocolo, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é outro parâmetro que é medido ao lado de dados OCR em experimentos XF. No entanto, o ECAR é muitas vezes mal ou incorretamente interpretado a partir de conjuntos de dados XF. Nós fornecemos um comentário sobre as limitações de cálculo do ECAR seguindo abordagens básicas do fabricante de tecnologia.

Protocol

Figura 1: Fluxo de trabalho gráfico para a geração de esferoides celulares, análise de fluxo extracelular e ensaios a jusante. Quatro linhas de células cancerígenas foram seletivamente cultivadas como monocamadas (A), separadas dos frascos da cultura tecidual, e semeadas em microplacas de 96 poços para formar esferoides (<str…

Representative Results

Para obter spheróides bem formados e compactos, cada linha celular foi otimizada individualmente para a densidade de semeadura e duração do cultivo (Figura 3). As linhas celulares A549, HepG2/C3A e SK-OV-3 inicialmente formaram agregados soltos que não progrediram para esferoides redondos com perímetros claramente definidos até depois de 7 dias na cultura. Por outro lado, as células MCF-7 podem formar esferoides dentro de 3 dias. Houve uma clara correlação entre a densidade inicial …

Discussion

Principais descobertas e saídas
Este artigo fornece um protocolo detalhado para sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando uma série de linhas celulares derivadas do câncer com o XFe96 XF Analyzer. Um método é desenvolvido e descrito para o rápido cultivo de Esferoides celulares A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 usando tecnologias repelentes celulares para agregação forçada. Este protocolo aborda muitas considerações sobre a sondagem do metabolismo esferoide …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.J.C foi apoiado por um Prêmio BBSRC MIBTP CASE com a Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Materials

A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. – Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. –
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling
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Citer Cet Article
Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).
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