Therapeutische evaluatie van fecale microbiotatransplantatie in een interleukine 10-deficiënt muismodel

Summary

De interactie van genetische gevoeligheid, mucosale immuniteit en intestinale micro-ecologische omgeving is betrokken bij de pathogenese van inflammatoire darmziekte (IBD). In deze studie pasten we fecale microbiota-transplantatie toe op IL-10-deficiënte muizen en onderzochten we de impact ervan op darmontsteking en hartfunctie.

Abstract

Met de ontwikkeling van micro-ecologie in de afgelopen jaren heeft de relatie tussen darmbacteriën en inflammatoire darmziekten (IBD) veel aandacht getrokken. Het verzamelen van bewijs suggereert dat dysbiotische microbiota een actieve rol speelt bij het activeren of verergeren van het ontstekingsproces bij IBD en dat fecale microbiotatransplantatie (FMT) een aantrekkelijke therapeutische strategie is, omdat het overbrengen van een gezonde microbiota naar IBD-patiënt de juiste gastheer-microbiota-communicatie zou kunnen herstellen. De moleculaire mechanismen zijn echter onduidelijk en de werkzaamheid van FMT is niet erg goed vastgesteld. Verdere studies in diermodellen van IBD zijn dus noodzakelijk. In deze methode pasten we FMT toe van wild-type C57BL / 6J-muizen naar IL-10-deficiënte muizen, een veelgebruikt muismodel van colitis. De studie gaat dieper in op het verzamelen van fecale pellets van de donormuizen, het maken van de fecale oplossing / suspensie, het toedienen van de fecale oplossing en het monitoren van de ziekte. We ontdekten dat FMT de hartinsufficiëntie bij IL-10 knock-out muizen aanzienlijk verminderde, wat het therapeutische potentieel voor IBD-beheer onderstreepte.

Introduction

Het menselijke darmmicro-ecosysteem is uiterst complex, met meer dan 1000 soorten bacteriën in de darm van een gezond persoon¹. De darmflora is betrokken bij het behoud van de normale fysiologische functies van de darm en de immuunrespons en heeft een onafscheidelijke relatie met het menselijk lichaam. Accumulerend bewijs suggereert dat het darmmicrobioom het laatste menselijke orgaan vormt, dat deel uitmaakt van het menselijk lichaam, niet alleen een groep parasieten². Een ‘gezonde’ symbiotische relatie tussen de darmmicrobiota, hun metabolieten en het immuunsysteem van de gastheer dat in het vroege leven is vastgesteld, is van cruciaal belang voor het behoud van de darmhomeostase. Bij sommige abnormale aandoeningen zoals chronische ontsteking verstoren veranderingen in de interne en externe omgeving van het lichaam de darmhomeostase ernstig, wat resulteert in een aanhoudende onbalans van de microbiële gemeenschap van de darm, dysbiose genaamd³. In feite kan blootstelling aan meerdere omgevingsfactoren, waaronder voeding, medicijnen en pathogenen, leiden tot veranderingen in de microbiota.

Dysbiose is geassocieerd met de pathogenese van een verscheidenheid aan darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte (IBD), prikkelbare darmsyndroom (IBS) en pseudomembraneuze enteritis, evenals een groeiende lijst van extra-intestinale aandoeningen, waaronder hart- en vaatziekten, obesitas en allergie⁴. Microbiotaprofilering toonde aan dat patiënten met IBD een dramatische afname van de bacteriële diversiteit hebben, evenals duidelijke veranderingen in de populaties van sommige specifieke bacteriestammen ^5,6. Deze studies toonden minder Lachnospiraceae en Bacteroidetes aan, maar meer Proteobacteria en Actinobacteriën bij IBD-patiënten. Er wordt aangenomen dat de pathogenese van IBD gerelateerd is aan verschillende pathogene factoren, waaronder abnormale darmflora, ontregelde immuunrespons, omgevingsuitdagingen en genetische varianten⁷. Overvloedig bewijs suggereert dat darmbacteriën een rol spelen in de initiatie- en toepassingsfasen van IBD ^8,9, wat aangeeft dat het corrigeren van darmdysbiose een nieuwe benadering kan zijn voor de therapie en / of onderhoudsbehandeling van IBD.

Het prototype van fecale microbiotatransplantatie (FMT) begon in het oude China¹⁰. In 1958 behandelden Dr. Eiseman en zijn collega’s met succes vier gevallen van ernstige pseudomembraneuze enteritis met fecale materie van gezonde donoren via klysma, waarmee een nieuw hoofdstuk in de moderne westerse geneeskunde werd geopend met behulp van menselijke uitwerpselen om menselijke ziekten te behandelen¹¹. Clostridium difficile-infectie (CDI) is de belangrijkste oorzaak van pseudomembraneuze enteritis¹² en FMT is zeer effectief bij de behandeling van CDI. In de afgelopen acht jaar is FMT een standaardbehandelingstherapie geworden voor de behandeling van recidiverende CDI¹³, wat aanleiding is geweest voor verdere studies naar de rol van FMT bij andere aandoeningen, zoals IBD. In de afgelopen twintig jaar hebben talloze case reports en cohortstudies het gebruik van FMT bij patiënten met IBD¹⁴ gedocumenteerd. Een meta-analyse, waaronder 12 onderzoeken, toonde aan dat 62% van de patiënten met de ziekte van Crohn (CD) klinische remissie bereikte na FMT, en 69% van de CD-patiënten had klinische respons¹⁵. Ondanks deze bemoedigende bevindingen blijft de rol van FMT bij de behandeling van IBD onzeker en zijn de mechanismen waarmee FMT darmontsteking verbetert slecht begrepen. Verder onderzoek is nodig voordat FMT zich kan aansluiten bij het huidige armamentarium van behandelingsopties voor IBD in de klinieken.

In dit protocol pasten we FMT toe op IL-10^-/- muizen, die spontaan colitis ontwikkelen na het spenen en hebben gediend als een gouden standaard om de multifactoriële aard van IBD ^16,17,18 te weerspiegelen. IL-10^−/− muizen zijn op grote schaal gebruikt om IBD-etiologie te ontleden omdat ze vergelijkbare moleculaire en histologische kenmerken vertonen als IBD-patiënten, en net als patiënten kan de ziekte worden verbeterd met anti-TNFα-therapie¹⁶. Ouder wordende IL10^−/− muizen (>9 maanden oud) hebben een grotere hartomvang en verminderde hartfunctie in vergelijking met leeftijdsgematchte wild-type muizen¹⁹, waardoor het een uitstekend model is voor het bestuderen van colitis-geïnduceerde hartaandoeningen. Andere muizenmodellen van colitis, zoals het dextran natriumsulfaatmodel en het T-cel-geïnduceerde colitismodel, kunnen echter ook worden gebruikt. We dienden fecale suspensie toe via orale maagsonde, waarvan bewezen is dat het een effectieve en betere route is dan klysma bij mensen²⁰.

Protocol

Alle procedures die op dieren werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Texas Medical Branch in Galveston (Protocol # 1512071A). 1. Verzameling van verse fecale pellets Bereid steriele papieren handdoeken, stompe tang en 50 ml conische buizen voor.Plaats wat papieren handdoekjes en tangen in aparte autoclaafzakken en autoclaaf ze bij 180 °C op droge hitte gedurende 30 minuten. Gebruik ook s…

Representative Results

We voerden 3 keer gezonde donor FMT uit (eenmaal per maand gedurende 3 maanden) op 2 maanden oude C57BL / 6J wild type (WT) en IL-10 knock-out muizen. Leeftijdsgematchte C57BL/6J-muizen (leeftijdsverschil moet <2 maanden) dienden als fecale donoren en telkens werden verse fecale pellets gebruikt. EIA-testen toonden aan dat BNP duidelijk verhoogd was in het plasma van IL-10-deficiëntiemuizen en dat gezonde donor FMT de toename van BNP-niveaus significant verzachtte (figuur 1A, n = 5, p</…

Discussion

Als een innovatieve onderzoeksbehandeling is FMT de afgelopen jaren een hot topic geworden bij de behandeling van verschillende aandoeningen, omdat dysbiose van de commensale microbiota betrokken is bij de pathogenese van meerdere menselijke ziekten, waaronder IBD, obesitas, diabetes mellitus, autisme, hartaandoeningen en kanker²⁶. Hoewel het mechanisme niet is bepaald, wordt aangenomen dat FMT werkt door een nieuwe biologische flora op te bouwen en het verlies van resterende bacteriën te voorkom…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA