Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.
As propriedades estruturais das ilhotas pancreáticas são fundamentais para a resposta funcional das células secretantes de insulina, glucagon e somatostatina, devido às suas implicações na comunicação intraisleta via sinalização elétrica, paracrina e autocririna. Neste protocolo, a arquitetura tridimensional de uma ilhota pancreática é primeiro reconstruída a partir de dados experimentais usando um novo algoritmo computacional. Em seguida, são obtidas as propriedades morfológicas e de conectividade da ilhota reconstruída, como o número e percentuais dos diferentes tipos de células, volume celular e contatos célula-célula. Em seguida, a teoria da rede é usada para descrever as propriedades de conectividade da ilhota através de métricas derivadas da rede, como grau médio, coeficiente de cluster, densidade, diâmetro e eficiência. Finalmente, todas essas propriedades são avaliadas funcionalmente através de simulações computacionais usando um modelo de osciladores acoplados. No geral, descrevemos aqui um fluxo de trabalho passo a passo, implementado no IsletLab, um aplicativo multiplataforma desenvolvido especificamente para o estudo e simulação de ilhotas pancreáticas, para aplicar uma nova metodologia computacional para caracterizar e analisar ilhotas pancreáticas como um complemento ao trabalho experimental.
O pâncreas é dividido em regiões referidas como cabeça, pescoço, corpo e cauda, cada uma com estruturas, funções e posição anatômicadiferentes 1,2. Do ponto de vista funcional, o pâncreas pode ser dividido em sistemas endócrinos e exócrinos com o primeiro responsável pela secreção de hormônios criticamente envolvidos na regulação da homeostase glicemia, enquanto este último contribui para a digestão alimentar através da secreção de enzimas no duodeno1. As ilhotas pancreáticas constituem o tecido endócrino do pâncreas e são responsáveis pela secreção de glucagon, insulina e somatostatina, secretadas de células de β, e δ, respectivamente3. Além de seus mecanismos de regulação intrínseca, essas células são reguladas via comunicação elétrica direta (entre células β e prováveis β e δ células), e também por sinalização paracrina e autocririna 4,5,6. Ambos os mecanismos são altamente dependentes da arquitetura de ilhotas (ou seja, a composição e organização dos diferentes tipos de células dentro da ilhota)7,8. É importante ressaltar que a arquitetura de ilhotas é alterada na presença de diabetes, provavelmente perturbando a comunicação intraisleta como resultado 9,10.
O estudo das ilhotas pancreáticas envolve uma ampla gama de metodologias experimentais. Entre elas, o uso de técnicas de fluorescência para determinar o número, localização e tipo das diferentes células da ilhota permitiu estudar as propriedades estruturais e morfológicas das ilhotas pancreáticas 11,12,13 e obter uma melhor compreensão das implicações funcionais em saúde e doença. Como complemento, modelos computacionais de células pancreáticas 14,15,16 e, mais recentemente, ilhotas pancreáticas 12,17,18,19 foram utilizadas nas últimas décadas para avaliar aspectos difíceis ou até impossíveis de abordar experimentalmente.
Neste protocolo, buscamos preencher a lacuna entre o trabalho experimental e computacional, delineando uma metodologia para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e conectividade por meio de métricas quantitativas e realizar simulações básicas para avaliar as implicações funcionais das propriedades ilhotas.
O protocolo descrito abaixo é baseado em algoritmos computacionais especificamente projetados para o estudo de ilhotas pancreáticas. Em resumo, na primeira etapa do protocolo, a arquitetura de ilhotas é reconstruída a partir de dados experimentais utilizando o algoritmo recentemente proposto por Félix-Martínez et al.19 em que posições nucleares obtidas através de 4′,6-diamidino-2-pheilndole (DAPI) coloração e tipos celulares identificados através de imunofluscência (como descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 ) são processados em um procedimento de otimização iterativo. Isso leva à determinação do tamanho e posição ideais de cada célula e à obtenção de uma ilhota composta de células não sobrepostas. Em segundo lugar, com base na arquitetura reconstruída, os contatos célula-célula são identificados para determinar as propriedades de conectividade e gerar a rede de ilhotas correspondente que permite ao usuário obter métricas quantitativas para descrever melhor a arquitetura de ilhotas (detalhes sobre o algoritmo de reconstrução podem ser consultados no trabalho original sobre o assunto19). Finalmente, simulações funcionais básicas são realizadas utilizando-se a abordagem de modelagem proposta por Hoang et al.12 em que, com base na natureza pulsante da secreção hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula é tratada como um oscilador e, portanto, a ilhota é representada como uma rede de osciladores acoplados seguindo as propriedades de conectividade da ilhota reconstruída.
Dada a complexidade computacional dos algoritmos utilizados neste protocolo, todas as etapas envolvidas foram implementadas em um aplicativo autônomo22 com o objetivo principal de abordar essas ferramentas computacionais para todos os leitores interessados, independentemente de seu nível de experiência no uso de software especializado ou linguagens de programação.
O protocolo acima descreve uma abordagem prática para reconstruir e analisar arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando novos algoritmos computacionais. O principal objetivo deste trabalho é permitir que a comunidade de pesquisa de ilhotas obtenha métricas quantitativas para caracterizar as propriedades morfológicas e conectividade das arquiteturas de ilhotas pancreáticas e avaliar as possíveis implicações funcionais dessas propriedades através de simulações computacionais.
<p class="jove_conten…The authors have nothing to disclose.
G.J. Félix-Martínez agradece ao CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e ao Departamento de Engenharia Elétrica da Universidad Autónoma Metropolitana (Cidade do México) pelo apoio dado a este projeto. Agradecemos ao Dr. Danh-Tai Hoang, ao Dr. Manami Hara e ao Dr. Junghyo Jo pelo excelente trabalho e generosidade em compartilhar as arquiteturas de ilhotas que tornaram esse trabalho possível com a comunidade de pesquisa.
CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |