مقارنة طرق عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة
Summary
يتم عزل المستعمرات الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة الاستوائية باستخدام طعم تينيبريو ، طعم غاليريا ، وكذلك الوسط الاصطناعي الانتقائي ، أي أجار سكر العنب البطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول ، الثيابيندازول ، وسيكلوهيكسيميد (وسط CTC).
Abstract
الهدف من هذه الدراسة هو مقارنة فعالية استخدام الطعوم الحشرية مقابل الوسط الانتقائي الاصطناعي لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) من عينات التربة. التربة هي موطن غني للكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك EPF التي تنتمي بشكل خاص إلى الأجناس Metarhizium و Beauveria ، والتي يمكن أن تنظم آفات المفصليات. تتوفر المنتجات البيولوجية القائمة على الفطريات في السوق بشكل رئيسي لمكافحة الآفات المفصلية الزراعية. ومع ذلك، وعلى الرغم من التنوع البيولوجي المتوطن المرتفع، لا يستخدم سوى عدد قليل من السلالات في المنتجات الحيوية التجارية في جميع أنحاء العالم. في هذه الدراسة ، تم استزراع 524 عينة تربة على أجار سكر العنب المخصب بالبطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول والثيابيندازول والسيكلوهيكسيميد (وسط CTC). لوحظ نمو المستعمرات الفطرية لمدة 3 أسابيع. تم تحديد جميع Metarhizium و Beauveria EPF مورفولوجيا على مستوى الجنس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد بعض العزلات جزيئيا على مستوى الأنواع. كما تم مسح 24 عينة من أصل 524 عينة من عينات التربة هذه بحثا عن حدوث EPF باستخدام طريقة طعم الحشرات (Galleria mellonella و Tenebrio molitor). تم عزل ما مجموعه 51 سلالة EPF (41 Metarhizium spp. و 10 Beauveria spp.) من عينات التربة 524. تم عزل جميع السلالات الفطرية إما عن الأراضي الزراعية أو الأراضي العشبية. ومن بين العينات ال 24 المختارة للمقارنة، كانت 91.7 في المائة إيجابية ل EPF باستخدام طعم غاليريا ، و 62.5 في المائة باستخدام طعم تينيبريو ، و 41.7 في المائة باستخدام CTC. أشارت نتائجنا إلى أن استخدام طعوم الحشرات لعزل EPF عن التربة أكثر كفاءة من استخدام وسط CTC. إن مقارنة طرق العزل بالإضافة إلى تحديد وحفظ EPF لها تأثير إيجابي على المعرفة حول التنوع البيولوجي. تحسين مجموعة EPF يدعم التطور العلمي والابتكار التكنولوجي.
Introduction
التربة هي مصدر العديد من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF). يتم التعرف على هذه المجموعة الخاصة من الفطريات من خلال قدرتها على استعمار وغالبا ما تقتل مضيفات المفصليات ، وخاصة الحشرات1. بعد العزل والتوصيف واختيار السلالات الخبيثة والتسجيل ، يتم إنتاج EPF بكميات كبيرة لمكافحة الآفات المفصلية ، مما يدعم أهميتها الاقتصادية2. وفقا لذلك ، يعتبر عزل EPF الخطوة الأولى لتطوير مبيد حيوي. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) و Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) هي الفطريات الأكثر شيوعا المستخدمة لمكافحة الآفات المفصلية3. تم عزل EPF بنجاح من التربة ، والمفصليات مع الفطار المرئي ، والنباتات المستعمرة ، وريزوسفير النبات 4,5.
يمكن أن تكون عزلة EPF مفيدة أيضا لدراسة تنوع وتوزيع وبيئة هذه المجموعة بالذات. ذكرت الأدبيات الحديثة أن استخدام EPF يتم التقليل من شأنه ، مستشهدا بالعديد من التطبيقات غير التقليدية ل EPF مثل قدرتها على تحسين نمو النبات4 ، لإزالة الملوثات السامة من التربة ، واستخدامها في الطب6. تهدف هذه الدراسة إلى مقارنة كفاءة عزل EPF عن التربة باستخدام طعوم الحشرات مقابل وسط الاستزراع الاصطناعي 7,8,9. تم قبول استخدام Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) كطعم للحشرات في سياق عزل EPF بشكل جيد. تستخدم هذه اليرقات في جميع أنحاء العالم من قبل المجتمع العلمي كنموذج تجريبي لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض10,11. تعتبر يرقة Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) نموذجا آخر للحشرات للدراسات التي تنطوي على ضراوة ولعزل EPF لأن هذه الحشرة من السهل ندرتها في المختبر بتكلفة منخفضة 7,12.
يمكن تطبيق طرق مستقلة عن الثقافة مثل استخدام مجموعة متنوعة من تقنيات PCR للكشف عن EPF وتحديده كميا على ركائزها ، بما في ذلك التربة13,14. ومع ذلك ، لعزل هذه المستعمرات الفطرية بشكل صحيح ، يجب استزراع ركيزتها على وسط اصطناعي انتقائي9 ، أو يمكن اصطياد الفطريات الموجودة في العينات باستخدام الحشرات الحساسة15. من ناحية ، CTC هو وسط اصطناعي خال من الدودين يتكون من أجار سكر العنب المخصب بالبطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول والثيابيندازول والسيكلوهيكسيميد. تم تطوير هذه الوسيلة من قبل فرنانديز وآخرون. 9 لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من Beauveria spp. و Metarhizium spp. من التربة. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا استخدام يرقات G. mellonella و T. molitor بنجاح كطعوم للحصول على عزلات EPF من التربة. ومع ذلك ، وفقا ل Sharma et al.15 ، أبلغ عدد أقل من الدراسات عن الاستخدام المصاحب والمقارنة بين هاتين الحشرتين الطعم. أظهرت تربة مزارع الكروم البرتغالية عمليات استرداد كبيرة ل Metarhizium robertsii (Metscn). سوروكين باستخدام T. يرقات موليتور بالمقارنة مع يرقات G. mellonella ؛ في المقابل ، بوفيريا باسيانا (Bals. -Criv.) تم ربط عزل Vuill باستخدام G. mellonella baits15. ولذلك، ينبغي النظر في القرار المتعلق بطريقة عزل EPF التي يجب استخدامها (أي G. mellonella-bait أو T. molitor-bait أو CTC medium) وفقا لهدف الدراسة والبنية التحتية للمختبر. الهدف من هذه الدراسة هو مقارنة فعالية استخدام طعوم الحشرات مقابل الوسط الانتقائي الاصطناعي لعزل EPF عن عينات التربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
موائل التربة الطبيعية والزراعية هي بيئات نموذجية ل EPF22 وخزان طبيعي ممتاز. في هذه الدراسة ، تم تناول طريقتين لعزل EPF باستخدام طعوم الحشرات مقابل الوسط الانتقائي. الخطوة الأولى للعزل هي جمع عينات التربة. التخزين السليم وتحديد عينات التربة أمر بالغ الأهمية. تعد المعلومات المتعلق…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مولت هذه الدراسة جزئيا من قبل لجنة الدراسات العليا في البرازيل (CAPES) ورمز التمويل 001 ومؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لإنفاذ الحقوق الدستورية في منطقة الأعمال العليا في ريو دي جانيرو (FAPERJ) (رقم المشروع E-26/010.001993/2015)، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) من البرازيل.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
