Sammenligning af metoder til isolering af entomopatogene svampe fra jordprøver
Summary
Entomopatogene svampekolonier isoleres fra tropiske jordprøver ved hjælp af Tenebrio agn, Galleria agn samt selektivt kunstigt medium, dvs. kartoffeldextrose agar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid (CTC medium).
Abstract
Målet med denne undersøgelse er at sammenligne effektiviteten af at bruge insektlokkemad versus kunstigt selektivt medium til isolering af entomopatogene svampe (EPF) fra jordprøver. Jorden er et rigt levested for mikroorganismer, herunder EPF, der især tilhører slægterne Metarhizium og Beauveria, som kan regulere leddyr skadedyr. Biologiske produkter baseret på svampe er tilgængelige på markedet hovedsagelig til bekæmpelse af leddyr i landbruget. På trods af den højendemiske biodiversitet anvendes kun få stammer i kommercielle bioprodukter over hele verden. I den foreliggende undersøgelse blev 524 jordprøver dyrket på kartoffeldextrose agar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid (CTC medium). Væksten af svampekolonier blev observeret i 3 uger. Alle Metarhizium og Beauveria EPF blev morfologisk identificeret på slægtsniveau. Derudover blev nogle isolater molekylært identificeret på artsniveau. Fireogtyve ud af disse 524 jordprøver blev også undersøgt for EPF-forekomst ved hjælp af insektagnmetoden (Galleria mellonella og Tenebrio molitor). I alt 51 EPF-stammer blev isoleret (41 Metarhizium spp. og 10 Beauveria spp.) fra de 524 jordprøver. Alle svampestammer blev isoleret enten fra dyrkede arealer eller græsarealer. Af de 24 prøver, der blev udvalgt til sammenligning, var 91,7% positive for EPF ved hjælp af Galleria agn, 62,5% ved hjælp af Tenebrio agn og 41,7% ved hjælp af CTC. Vores resultater antydede, at det er mere effektivt at bruge insektlokkemad til at isolere EPF fra jorden end at bruge CTC-mediet. Sammenligningen af isolationsmetoder ud over identifikationen og bevarelsen af EPF har en positiv indvirkning på viden om biodiversitet. Forbedringen af indsamlingen af EPF støtter videnskabelig udvikling og teknologisk innovation.
Introduction
Jord er kilden til flere mikroorganismer, herunder entomopatogene svampe (EPF). Denne særlige gruppe af svampe genkendes af deres evne til at kolonisere og ofte dræbe leddyrværter, især insekter1. Efter isolering, karakterisering, udvælgelse af virulente stammer og registrering masseproduceres EPF til leddyr-skadedyrsbekæmpelse, hvilket understøtter deres økonomiske relevans2. Følgelig betragtes isoleringen af EPF som det første skridt til udviklingen af et biopesticid. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) og Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) er de mest almindelige svampe, der anvendes til leddyr-skadedyrsbekæmpelse3. EPF er med succes blevet isoleret fra jord, leddyr med synlig mykose, koloniserede planter og plante rhizosfære 4,5.
Isolering af EPF kan også være nyttigt at studere mangfoldigheden, distributionen og økologien i denne særlige gruppe. Nyere litteratur rapporterede, at brugen af EPF er undervurderet, idet der henvises til flere ukonventionelle anvendelser af EPF, såsom deres evne til at forbedre plantevæksten4, fjerne giftige forurenende stoffer fra jorden og anvende dem i medicin6. Den foreliggende undersøgelse har til formål at sammenligne effektiviteten af isolering af EPF fra jord ved hjælp af insektlokkemad versus kunstigt kulturmedium 7,8,9. Brugen af Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insektagn i forbindelse med EPF-isolering er blevet godt accepteret. Disse larver bruges over hele verden af det videnskabelige samfund som en eksperimentel model til at studere værtspatogeninteraktioner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larve betragtes som en anden insektmodel til undersøgelser, der involverer virulens og til isolering af EPF, da dette insekt er let at sjældent i laboratoriet til en lav pris 7,12.
Kulturuafhængige metoder såsom anvendelse af en række PCR-teknikker kan anvendes til at detektere og kvantificere EPF på deres substrater, herunder jord13,14. For at isolere disse svampekolonier korrekt skal deres substrat dog dyrkes på et selektivt kunstigt medium9, eller de svampe, der er til stede i prøverne, kan lokkes ved hjælp af følsomme insekter15. På den ene side er CTC et dodinfrit kunstigt medium, der består af kartoffeldextroseagar beriget med gærekstrakt suppleret med chloramphenicol, thiabendazol og cycloheximid. Dette medium blev udviklet af Fernandes et al. 9 for at maksimere genopretningen af naturligt forekommende Beauveria spp. og Metarhizium spp. fra jorden. På den anden side kan G. mellonella og T. molitor larver også med succes anvendes som lokkemad for at opnå EPF-isolater fra jorden. Ikke desto mindre rapporterede færre undersøgelser ifølge Sharma et al.15 den samtidige brug og sammenligning af disse to agninsekter. Portugisiske vinmarker jord udviste betydelige genvindinger af Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin ved hjælp af T. molitor larver i sammenligning med G. mellonella larver; i modsætning hertil Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolation var forbundet med brugen af G. mellonella lokkemad15. Derfor bør beslutningen om, hvilken EPF-isolationsmetode der skal anvendes (dvs. G. mellonella-agn, T. molitor-agn eller CTC-medium), overvejes i henhold til undersøgelsens mål og laboratorieinfrastrukturen. Målet med denne undersøgelse er at sammenligne effektiviteten af at bruge insektlokkemad versus kunstigt selektivt medium til isolering af EPF fra jordprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Natur- og landbrugsjordhabitater er typiske miljøer for EPF22 og et fremragende naturreservoir. I den foreliggende undersøgelse blev to metoder til EPF-isolering ved hjælp af insektlokkemad versus selektivt medium behandlet. Det første skridt til isolering er indsamlingen af jordprøverne. Korrekt opbevaring og identifikation af jordprøver er afgørende. Oplysninger om breddegrad, længdegrad, jordtype og biom er afgørende for undersøgelser, der involverer epidemiologiske, modellerings- og …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasilien, finanskode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projektnummer E-26/010.001993/2015) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) fra Brasilien.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
