השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע
Summary
מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).
Abstract
מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. האדמה היא בית גידול עשיר למיקרואורגניזמים, כולל EPF השייך במיוחד לסוגים Metarhizium ו – Beauveria, שיכולים לווסת מזיקים פרוקי רגליים. מוצרים ביולוגיים המבוססים על פטריות זמינים בשוק בעיקר להדברת פרוקי רגליים חקלאיים. עם זאת, למרות המגוון הביולוגי האנדמי הגבוה, רק זנים מעטים משמשים בתוצרים ביולוגיים מסחריים ברחבי העולם. במחקר הנוכחי, 524 דגימות קרקע הועתקו בתרבית על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלורמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC). הצמיחה של מושבות פטריות נצפתה במשך 3 שבועות. כל Metarhizium ו – Beauveria EPF זוהו באופן מורפולוגי ברמת הסוג. בנוסף, חלק מהמבודדים זוהו מולקולרית ברמת המין. 24 מתוך 524 דגימות הקרקע הללו נסקרו גם הן לצורך התרחשות EPF בשיטת פיתיון החרקים (Galleria mellonella ו-Tenebrio molitor). בסך הכל בודדו 51 זני EPF (41 זני Metarhizium spp. ו-10 Beauveria spp.) מתוך 524 דגימות הקרקע. כל הזנים הפטרייתיים בודדו משטחי יבול או מרעה. מתוך 24 הדגימות שנבחרו להשוואה, 91.7% היו חיוביות ל-EPF באמצעות פיתיון גלריה , 62.5% השתמשו בפיתיון Tenebrio ו-41.7% השתמשו ב-CTC. התוצאות שלנו הצביעו על כך ששימוש בפיתיונות חרקים כדי לבודד את ה-EPF מהאדמה יעיל יותר משימוש במדיום CTC. להשוואת שיטות הבידוד בנוסף לזיהוי ולשימור של EPF יש השפעה חיובית על הידע על המגוון הביולוגי. השיפור של אוסף EPF תומך בפיתוח מדעי ובחדשנות טכנולוגית.
Introduction
אדמה היא המקור למספר מיקרואורגניזמים, כולל פטריות אנטומופתוגניות (EPF). קבוצה מסוימת זו של פטריות מוכרת על ידי יכולתן להתיישב ולעתים קרובות להרוג פונדקאים של פרוקי רגליים, במיוחד חרקים1. לאחר בידוד, אפיון, בחירת זנים ארסיים ורישום, EPF מיוצרים בייצור המוני להדברת פרוקי רגליים, התומכת ברלוונטיות הכלכלית שלהם2. לפיכך, הבידוד של EPF נחשב הצעד הראשון לפיתוח של biopesticide. Beauveria spp. (היפוקריאלס: Cordycipitaceae) ו-Metarhizium spp. (היפוקריאלס: Clavicipitaceae) הן הפטריות הנפוצות ביותר המשמשות להדברת פרוקי רגליים3. EPF בודדו בהצלחה מהאדמה, פרוקי רגליים עם מיקוזיס נראית לעין, צמחים מיושבים וריזוספירה צמחית 4,5.
בידוד של EPF יכול להיות שימושי גם כדי לחקור את המגוון, ההפצה והאקולוגיה של קבוצה מסוימת זו. ספרות עדכנית דיווחה כי השימוש ב- EPF אינו מוערך כראוי, וציטט מספר יישומים לא קונבנציונליים של EPF כגון יכולתם לשפר את צמיחת הצמח4, להסיר מזהמים רעילים מהאדמה, ולהשתמש בהם ברפואה6. המחקר הנוכחי נועד להשוות את היעילות של בידוד EPF מהאדמה באמצעות פיתיונות חרקים לעומת תווך תרבית מלאכותית 7,8,9. השימוש ב-Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) כפיתיון חרקים בהקשר של בידוד EPF התקבל היטב. זחלים אלה משמשים ברחבי העולם את הקהילה המדעית כמודל ניסיוני לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגנים10,11. זחל Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) נחשב למודל חרקים נוסף למחקרים המערבים אלימות ובידוד של EPF מכיוון שחרק זה קל לנדיר במעבדה בעלות נמוכהשל 7,12.
ניתן ליישם שיטות שאינן תלויות בתרבית כגון שימוש במגוון טכניקות PCR כדי לזהות ולכמת EPF על המצעים שלהם, כולל קרקע13,14. עם זאת, כדי לבודד כראוי את המושבות הפטרייתיות הללו, יש לתרבת את המצע שלהן על מדיום מלאכותי סלקטיבי9, או שניתן יהיה לפתות את הפטריות הקיימות בדגימות באמצעות חרקים רגישים15. מצד אחד, CTC הוא מדיום מלאכותי נטול Dodine המורכב מתפוחי אדמה דקסטרוז אגר מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד. מדיום זה פותח על ידי פרננדס ואחרים. 9 כדי למקסם את ההתאוששות של Beauveria spp. ו– Metarhizium spp. ממקור טבעי מהאדמה. מצד שני, זחלי G. mellonella ו– T. molitor יכולים לשמש בהצלחה גם כפיתיונות כדי להשיג מבודדי EPF מהאדמה. עם זאת, על פי שארמה ואחרים,15, פחות מחקרים דיווחו על שימוש והשוואה מקבילים בין שני חרקי הפיתיון הללו. בקרקעות הכרמים הפורטוגזיות נמצאו שחזורים משמעותיים של Metarhizium robertsii (Metscn.) סורוקין משתמש ב-T. זחלי מוליטור בהשוואה לזחלי G. mellonella; לעומת זאת, בובריה בסיאנה (בלס. -Criv.) בידוד Vuill נקשר לשימוש בפיתיונות G. mellonella 15. לפיכך, יש לשקול את ההחלטה באיזו שיטת בידוד EPF להשתמש (כלומר, G. mellonella-fiit, T. molitor-fiit או CTC medium) בהתאם למטרת המחקר ולתשתית המעבדה. מטרת המחקר הנוכחי היא להשוות את היעילות של שימוש בפיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי מלאכותי לבידוד EPF מדגימות קרקע.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתי גידול טבעיים וחקלאיים בקרקע הם סביבות אופייניות ל-EPF22 ומאגר טבעי מצוין. במחקר הנוכחי טופלו שתי שיטות לבידוד EPF באמצעות פיתיונות חרקים לעומת מדיום סלקטיבי. הצעד הראשון לבידוד הוא איסוף דגימות הקרקע. אחסון וזיהוי נכונים של דגימות קרקע הם חיוניים. מידע על קו הרוחב, קו האורך, ס?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) מברזיל, קוד מימון 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (מספר פרויקט E-26/010.001993/2015), ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) מברזיל.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
