土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較
Summary
昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア 餌、ならびに選択的人工培地、すなわちクロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天(CTC培地)を用いて熱帯土壌サンプルから単離される。
Abstract
本研究の目的は、土壌サンプルから昆虫病原性真菌(EPF)を単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。土壌は微生物の豊かな生息地であり、特に節足動物の害虫を調節できる メタリシウム 属および ボーベリア属に属するEPFを含む。真菌に基づく生物学的製剤は、主に農業節足動物有害生物防除のために市場で入手可能である。それにもかかわらず、高い固有種の生物多様性にもかかわらず、世界中の市販のバイオ製品に使用されている株はごくわずかです。本研究では、524の土壌サンプルを、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシイミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天培地(CTC培地)上で培養した。真菌コロニーの成長を3週間観察した。すべての メタリジウム および ボーベリア EPFは、属レベルで形態学的に同定された。さらに、いくつかの分離株は種レベルで分子的に同定された。これら524の土壌サンプルのうち24個は、昆虫餌法(Galleria mellonella および Tenebrio molitor)を用いてEPFの発生についても調査された。合計51のEPF株(41の メタリシウム 属および10 種のボーベリア 属)を524の土壌サンプルから単離した。すべての真菌株は、耕作地または草原のいずれかから単離された。比較のために選択された24サンプルのうち、91.7%が ガレリア 餌を用いたEPFに対して陽性であり、62.5%が テネブリオ 餌を用いて、および41.7%がCTCを用いて陽性であった。我々の結果は、昆虫餌を使用して土壌からEPFを単離することが、CTC培地を使用するよりも効率的であることを示唆した。EPFの同定と保全に加えて、分離方法の比較は、生物多様性に関する知識にプラスの影響を与えます。EPFコレクションの改善は、科学の発展と技術革新を支援します。
Introduction
土壌は、昆虫病原性真菌(EPF)を含むいくつかの微生物の供給源である。真菌のこの特定のグループは、節足動物宿主、特に昆虫1をコロニー形成し、しばしば殺す能力によって認識される。単離、特性評価、毒性株の選択、および登録後、EPFは節足動物 – 害虫防除のために大量生産され、その経済的関連性を支持する2。したがって、EPFの単離は、バイオ殺有害生物剤の開発への第一歩と考えられている。ボーベリア属(Hypocreales:Cordycipitaceae)およびMetarhizium spp.(Hypocreales:Clavicipitaceae)は、節足動物 – 害虫防除に使用される最も一般的な真菌である3。EPFは、土壌、目に見える真菌症を有する節足動物、コロニー形成植物、および植物根圏4,5から首尾よく単離されている。
EPFの単離は、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのにも有用であり得る。最近の文献は、EPFの使用が過小評価されていると報告し、植物の成長を改善する能力4、土壌から有毒な汚染物質を除去する能力、および薬6に使用されるEPFのいくつかの非従来型用途を引用している。本研究は、昆虫餌を用いた土壌からのEPFの単離効率を人工培養培地7、8、9と比較することを目的とする。Galleria mellonella L.(鱗翅目:Phyralidae)を昆虫の餌として使用することは、EPF単離の文脈でよく受け入れられている。これらの幼虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための実験モデルとして、科学界によって世界中で使用されている10,11。Tenebrio molitor L. (鞘翅目:Tenebrionidae)幼虫は、この昆虫が低コストで実験室でまれにしやすいため、毒性を伴う研究およびEPFの単離のための別の昆虫モデルと考えられている7,12。
様々なPCR技術を用いるなどの培養に依存しない方法を適用して、土壌13、14を含むそれらの基質上のEPFを検出および定量することができる。それにもかかわらず、これらの真菌コロニーを適切に単離するためには、それらの基質を選択的人工培地9上で培養するか、または試料中に存在する真菌を感受性昆虫15を用いて餌付けすることができる。一方、CTCは、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天からなるドジンフリーの人工培地である。この培地はフェルナンデスらによって開発された。9は土壌からの天然に存在するボーベリア属およびメタリジウム属菌の回収率を最大化する。一方、G. mellonellaおよびT. molitor幼虫は、土壌からEPF分離株を得るための餌として首尾よく使用することもできる。それにもかかわらず、Sharma et al.15によると、これら2つの餌昆虫の併用と比較を報告した研究は少なかった。ポルトガルのブドウ畑の土壌は、メタリシウム・ロベルツィイ(Metscn)の大幅な回復を示した。ソロキンはTを用いた。 G.メロネラ幼虫と比較したモリター幼虫;対照的に、ボーヴェリア・バッシアナ(バルス・クライブ)ヴュイル単離は、G.メロネラ餌15の使用と関連していた。したがって、どのEPF単離方法(すなわち、G. mellonella-bait、T. molitor-baitまたはCTC培地)を使用するかの決定は、研究の目標および実験室インフラストラクチャに従って考慮されるべきである。本研究の目的は、土壌サンプルからEPFを単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
自然土壌と農業土壌の生息地は、EPF22の典型的な環境であり、優れた自然の貯水池です。本研究では、昆虫餌対選択的培地を用いたEPF単離の2つの方法が取り組まれた。単離のための最初のステップは、土壌サンプルの収集である。土壌サンプルの適切な保管と同定は非常に重要です。緯度、経度、土壌タイプ、バイオームに関する情報は、疫学的、モデリング的、および地?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ブラジルのCoordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)、財務コード001、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)(プロジェクト番号E-26/010.001993/2015)、ブラジルのConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
