Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo
Summary
Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).
Abstract
El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus medio selectivo artificial para aislar hongos entomopatógenos (EPF) de muestras de suelo. El suelo es un hábitat rico en microorganismos, incluyendo EPF particularmente perteneciente a los géneros Metarhizium y Beauveria, que pueden regular las plagas de artrópodos. Los productos biológicos a base de hongos están disponibles en el mercado principalmente para el control de plagas de artrópodos agrícolas. Sin embargo, a pesar de la alta biodiversidad endémica, solo unas pocas cepas se utilizan en bioproductos comerciales en todo el mundo. En el presente estudio, se cultivaron 524 muestras de suelo en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC). El crecimiento de colonias de hongos se observó durante 3 semanas. Todos los Metarhizium y Beauveria EPF fueron identificados morfológicamente a nivel de género. Además, algunos aislamientos fueron identificados molecularmente a nivel de especie. Veinticuatro de estas 524 muestras de suelo también fueron estudiadas para detectar la aparición de EPF utilizando el método de cebo para insectos (Galleria mellonella y Tenebrio molitor). Se aislaron un total de 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. y 10 Beauveria spp.) de las 524 muestras de suelo. Todas las cepas de hongos se aislaron de tierras de cultivo o pastizales. De las 24 muestras seleccionadas para la comparación, el 91,7% fueron positivas para EPF con cebo Galleria , el 62,5% con cebo Tenebrio y el 41,7% con CTC. Nuestros resultados sugirieron que el uso de cebos de insectos para aislar el EPF del suelo es más eficiente que el uso del medio CTC. La comparación de métodos de aislamiento además de la identificación y conservación de EPF tiene un impacto positivo en el conocimiento sobre la biodiversidad. La mejora de la colección EPF apoya el desarrollo científico y la innovación tecnológica.
Introduction
El suelo es la fuente de varios microorganismos, incluidos los hongos entomopatógenos (EPF). Este grupo particular de hongos es reconocido por su capacidad para colonizar y a menudo matar a los huéspedes artrópodos, especialmente a los insectos1. Después del aislamiento, la caracterización, la selección de cepas virulentas y el registro, los EPF se producen en masa para el control de plagas de artrópodos, lo que respalda su relevancia económica2. En consecuencia, el aislamiento de EPF se considera el primer paso para el desarrollo de un bioplaguicida. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) y Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) son los hongos más comunes utilizados para el control de plagas de artrópodos3. Los EPF se han aislado con éxito del suelo, artrópodos con micosis visible, plantas colonizadas y rizosfera vegetal 4,5.
El aislamiento de EPF también puede ser útil para estudiar la diversidad, distribución y ecología de este grupo en particular. La literatura reciente informó que el uso de EPF está subestimado, citando varias aplicaciones no convencionales de EPF, como su capacidad para mejorar el crecimiento de las plantas4, para eliminar contaminantes tóxicos del suelo y para ser utilizado en medicina6. El presente estudio tiene como objetivo comparar la eficiencia de aislar EPF del suelo utilizando cebos para insectos versus medio de cultivo artificial 7,8,9. El uso de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como cebo para insectos en el contexto del aislamiento de EPF ha sido bien aceptado. Estas larvas son utilizadas en todo el mundo por la comunidad científica como modelo experimental para estudiar las interacciones huésped-patógeno10,11. La larva de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) se considera otro modelo de insecto para estudios que involucran virulencia y para el aislamiento de EPF ya que este insecto es fácil de rarar en el laboratorio a un bajo costo 7,12.
Se pueden aplicar métodos independientes del cultivo, como el uso de una variedad de técnicas de PCR, para detectar y cuantificar EPF en sus sustratos, incluido el suelo13,14. Sin embargo, para aislar adecuadamente estas colonias de hongos, su sustrato debe cultivarse en un medio artificial selectivo9, o los hongos presentes en las muestras pueden ser cebados utilizando insectos sensibles15. Por un lado, CTC es un medio artificial libre de dodina que consiste en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida. Este medio fue desarrollado por Fernandes et al. 9 para maximizar la recuperación de Beauveria spp. y Metarhizium spp. naturales del suelo. Por otro lado, las larvas de G. mellonella y T. molitor también pueden utilizarse con éxito como cebos para obtener aislados de EPF del suelo. Sin embargo, según Sharma et al.15, menos estudios reportaron el uso concomitante y la comparación de estos dos insectos de cebo. Los suelos de los viñedos portugueses exhibieron recuperaciones significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas de molitor en comparación con larvas de G. mellonella; en contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) El aislamiento de Vuill se relacionó con el uso de cebos de G. mellonella 15. Por lo tanto, la decisión sobre qué método de aislamiento de EPF utilizar (es decir, G. mellonella-bait, T. molitor-bait o CTC medium) debe considerarse de acuerdo con el objetivo del estudio y la infraestructura del laboratorio. El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus el medio selectivo artificial para aislar EPF de muestras de suelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los hábitats naturales y agrícolas del suelo son ambientes típicos de EPF22 y un excelente reservorio natural. En el presente estudio, se abordaron dos métodos de aislamiento de EPF utilizando cebos de insectos versus medio selectivo. El primer paso para el aislamiento es la recolección de las muestras de suelo. El almacenamiento adecuado y la identificación de muestras de suelo son cruciales. La información sobre la latitud, longitud, tipo de suelo y bioma es esencial para los estudios que…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado en parte por la Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) de Brasil, código financiero 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (número de proyecto E-26/010.001993/2015), y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) de Brasil.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
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