Jämförelse av metoder för att isolera entomopatogena svampar från jordprover
Summary
Entomopatogena svampkolonier isoleras från tropiska jordprover med Tenebrio bete, Galleria bete, liksom selektivt konstgjort medium, dvs potatis dextros agar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid (CTC-medium).
Abstract
Målet med föreliggande studie är att jämföra effektiviteten av att använda insektsbeten kontra artificiellt selektivt medium för att isolera entomopatogena svampar (EPF) från jordprover. Marken är en rik livsmiljö för mikroorganismer, inklusive EPF som särskilt tillhör släktena Metarhizium och Beauveria, som kan reglera leddjur skadedjur. Biologiska produkter baserade på svampar finns på marknaden främst för bekämpning av leddjur i jordbruket. Trots den höga endemiska biologiska mångfalden används dock endast ett fåtal stammar i kommersiella bioprodukter över hela världen. I den aktuella studien odlades 524 jordprover på potatisdextrosagar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid (CTC-medium). Tillväxten av svampkolonier observerades i 3 veckor. Alla Metarhizium och Beauveria EPF identifierades morfologiskt på släktnivå. Dessutom identifierades vissa isolat molekylärt på artnivå. Tjugofyra av dessa 524 jordprover undersöktes också för EPF-förekomst med insektsbetemetoden (Galleria mellonella och Tenebrio molitor). Totalt isolerades 51 EPF-stammar (41 Metarhizium spp. och 10 Beauveria spp.) från de 524 jordproverna. Alla svampstammar isolerades antingen från odlingsmarker eller gräsmarker. Av de 24 prover som valdes ut för jämförelse var 91,7% positiva för EPF med Galleria-bete , 62,5% med Tenebrio-bete och 41,7% med CTC. Våra resultat föreslog att det är effektivare att använda insektsbeten för att isolera EPF från jorden än att använda CTC-mediet. Jämförelsen av isoleringsmetoder utöver identifieringen och bevarandet av epf har en positiv inverkan på kunskapen om biologisk mångfald. Förbättringen av EPF-insamlingen stöder vetenskaplig utveckling och teknisk innovation.
Introduction
Jord är källan till flera mikroorganismer, inklusive entomopatogena svampar (EPF). Denna speciella grupp av svampar känns igen av deras förmåga att kolonisera och ofta döda leddjursvärdar, särskilt insekter1. Efter isolering, karakterisering, urval av virulenta stammar och registrering massproduceras EPF för bekämpning av leddjur-skadedjur, vilket stöder deras ekonomiska relevans2. Följaktligen anses isoleringen av EPF vara det första steget till utvecklingen av en biopesticid. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) och Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) är de vanligaste svamparna som används för arthropod-skadedjursbekämpning3. EPF har framgångsrikt isolerats från jord, leddjur med synlig mykos, koloniserade växter och växtrhizosfär 4,5.
Isolering av EPF kan också vara användbar för att studera mångfalden, distributionen och ekologin hos denna speciella grupp. Ny litteratur rapporterade att användningen av EPF är underskattad, med hänvisning till flera okonventionella tillämpningar av EPF, såsom deras förmåga att förbättra växttillväxten4, för att avlägsna giftiga föroreningar från jorden och för att användas i medicin6. Den föreliggande studien syftar till att jämföra effektiviteten av att isolera EPF från jord med insektsbeten jämfört med artificiellt odlingsmedium 7,8,9. Användningen av Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) som insektsbete i samband med EPF-isolering har accepterats väl. Dessa larver används över hela världen av det vetenskapliga samfundet som en experimentell modell för att studera värd-patogeninteraktioner10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larv anses vara en annan insektsmodell för studier som involverar virulens och för isolering av EPF eftersom denna insekt är lätt att sällsynt i laboratoriet till en låg kostnad 7,12.
Kulturoberoende metoder som att använda en mängd olika PCR-tekniker kan tillämpas för att detektera och kvantifiera EPF på deras substrat, inklusive jord13,14. För att korrekt isolera dessa svampkolonier bör deras substrat odlas på ett selektivt konstgjort medium9, eller svamparna som finns i proverna kan agnas med känsliga insekter15. Å ena sidan är CTC ett dodinfritt konstgjort medium som består av potatisdextrosagar berikad med jästextrakt kompletterat med kloramfenikol, tiabendazol och cykloheximid. Detta medium utvecklades av Fernandes et al. 9 för att maximera återhämtningen av naturligt förekommande Beauveria spp. och Metarhizium spp. från jorden. Å andra sidan kan G. mellonella och T. molitor larver också framgångsrikt användas som beten för att erhålla EPF-isolat från jorden. Men enligt Sharma et al.15 rapporterade färre studier samtidig användning och jämförelse av dessa två betesinsekter. Portugisiska vingårdar jordar uppvisade betydande återvinningar av Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin med T. molitor larver i jämförelse med G. mellonella larver; däremot Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill isolering var kopplad till användningen av G. mellonella beten15. Därför bör beslutet om vilken EPF-isoleringsmetod som ska användas (dvs. G. mellonella-bete, T. molitor-bete eller CTC-medium) övervägas i enlighet med studiens mål och laboratorieinfrastrukturen. Målet med föreliggande studie är att jämföra effektiviteten av att använda insektsbeten kontra artificiellt selektivt medium för att isolera EPF från markprover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Livsmiljöer för natur- och jordbruksmark är typiska miljöer för EPF22 och en utmärkt naturreservat. I den aktuella studien behandlades två metoder för EPF-isolering med insektsbeten kontra selektivt medium. Det första steget för isolering är insamlingen av markproverna. Korrekt lagring och identifiering av markprover är avgörande. Information om latitud, longitud, jordtyp och biom är avgörande för studier som involverar epidemiologiska, modellerande och geospatiala ämnen<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades delvis av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) från Brasilien, finanskod 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (projektnummer E-26/010.001993/2015) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) från Brasilien.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
- Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
- do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
- Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
- Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
- Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
- Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
- Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
- Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
- Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
- Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933 (2016).
- Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’ as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
- Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
- Seifert, K. A., Gams, W., Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. 9, 903-906 (2011).
- Humber, R. A., Lacey, L. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. , 151-187 (2012).
- Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
- St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
- Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
- Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
- Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
- Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
- Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
- Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
- Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
- Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
