Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben
Summary
Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.
Abstract
Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben zu vergleichen. Der Boden ist ein reicher Lebensraum für Mikroorganismen, darunter EPF, die insbesondere zu den Gattungen Metarhizium und Beauveria gehören, die Arthropodenschädlinge regulieren können. Biologische Produkte auf der Basis von Pilzen sind auf dem Markt hauptsächlich für die Schädlingsbekämpfung von landwirtschaftlichen Arthropoden erhältlich. Trotz der hohen endemischen Biodiversität werden weltweit nur wenige Stämme in kommerziellen Bioprodukten verwendet. In der vorliegenden Studie wurden 524 Bodenproben auf Kartoffeldextrose-Agar kultiviert, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium). Das Wachstum von Pilzkolonien wurde 3 Wochen lang beobachtet. Alle Metarhizium und Beauveria EPF wurden morphologisch auf Gattungsebene identifiziert. Darüber hinaus wurden einige Isolate molekular auf Speziesebene identifiziert. Vierundzwanzig dieser 524 Bodenproben wurden auch mit der Insektenködermethode (Galleria mellonella und Tenebrio molitor) auf EPF-Vorkommen untersucht. Aus den 524 Bodenproben wurden insgesamt 51 EPF-Stämme isoliert (41 Metarhizium spp. und 10 Beauveria spp.). Alle Pilzstämme wurden entweder aus Ackerland oder Grasland isoliert. Von den 24 zum Vergleich ausgewählten Proben waren 91,7% positiv auf EPF mit Galleria-Ködern , 62,5% mit Tenebrio-Köder und 41,7% mit CTC. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung von Insektenködern zur Isolierung der EPF aus dem Boden effizienter ist als die Verwendung des CTC-Mediums. Der Vergleich von Isolationsmethoden neben der Identifizierung und Konservierung von EPF wirkt sich positiv auf das Wissen über Biodiversität aus. Die Verbesserung der EPF-Sammlung unterstützt die wissenschaftliche Entwicklung und technologische Innovation.
Introduction
Der Boden ist die Quelle mehrerer Mikroorganismen, einschließlich entomopathogener Pilze (EPF). Diese besondere Gruppe von Pilzen wird durch ihre Fähigkeit erkannt, Arthropodenwirte, insbesondere Insekten, zu besiedeln und oft zu töten1. Nach Isolierung, Charakterisierung, Auswahl virulenter Stämme und Registrierung werden EPF für die Arthropoden-Schädlingsbekämpfung in Massenproduktion hergestellt, was ihre wirtschaftliche Relevanzunterstützt 2. Dementsprechend gilt die Isolierung von EPF als erster Schritt zur Entwicklung eines Biopestizids. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) und Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sind die häufigsten Pilze, die zur Arthropoden-Schädlingsbekämpfungeingesetzt werden 3. EPF wurden erfolgreich aus dem Boden, Arthropoden mit sichtbarer Mykose, kolonisierten Pflanzen und der Pflanzenrhizosphäre 4,5 isoliert.
Die Isolierung von EPF kann auch nützlich sein, um die Vielfalt, Verteilung und Ökologie dieser speziellen Gruppe zu untersuchen. Jüngste Literatur berichtete, dass die Verwendung von EPF unterschätzt wird, und zitierte mehrere unkonventionelle Anwendungen von EPF, wie ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu verbessern4, toxische Verunreinigungen aus dem Boden zu entfernen und in der Medizin verwendetzu werden 6. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Effizienz der Isolierung von EPF aus dem Boden mit Insektenködern im Vergleich zum künstlichen Kulturmedium 7,8,9 zu vergleichen. Die Verwendung von Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) als Insektenköder im Rahmen der EPF-Isolierung wurde gut angenommen. Diese Larven werden weltweit von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als experimentelles Modell zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionenverwendet 10,11. Die Larve Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) gilt als ein weiteres Insektenmodell für Studien mit Virulenz und zur Isolierung von EPF, da dieses Insekt im Labor zu geringen Kosten leicht bis selten ist 7,12.
Kulturunabhängige Methoden wie die Verwendung einer Vielzahl von PCR-Techniken können angewendet werden, um EPF auf ihren Substraten, einschließlich Boden13,14, nachzuweisen und zu quantifizieren. Um diese Pilzkolonien jedoch richtig zu isolieren, sollte ihr Substrat auf ein selektives künstliches Medium9 kultiviert werden, oder die in den Proben vorhandenen Pilze können mit empfindlichen Insekten15 geködert werden. Auf der einen Seite ist CTC ein dodinfreies künstliches Medium, das aus Kartoffeldextrose-Agar besteht, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid. Dieses Medium wurde von Fernandes et al. entwickelt. 9 zur Maximierung der Erholung von natürlich vorkommenden Beauveria spp. und Metarhizium spp. aus dem Boden. Auf der anderen Seite können G. mellonella und T. molitor Larven auch erfolgreich als Köder verwendet werden, um EPF-Isolate aus dem Boden zu gewinnen. Laut Sharma et al.15 berichteten jedoch weniger Studien über die gleichzeitige Verwendung und den Vergleich dieser beiden Köderinsekten. Portugiesische Weinbergsböden zeigten signifikante Gewinnungsraten von Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin mit T. Molitorlarven im Vergleich zu G. mellonella Larven; im Gegensatz dazu Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Die Vivill-Isolierung war mit der Verwendung von G. mellonella-Ködern 15 verbunden. Daher sollte die Entscheidung, welche EPF-Isolationsmethode verwendet werden soll (d. h. G. mellonella-Köder, T. molitor-köder oder CTC-Medium), entsprechend dem Ziel der Studie und der Laborinfrastruktur berücksichtigt werden. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung von EPF aus Bodenproben zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Natürliche und landwirtschaftliche Bodenlebensräume sind typische Umgebungen für EPF22 und ein ausgezeichnetes natürliches Reservoir. In der vorliegenden Studie wurden zwei Methoden der EPF-Isolierung mit Insektenködern im Vergleich zu selektivem Medium untersucht. Der erste Schritt zur Isolierung ist die Entnahme der Bodenproben. Die ordnungsgemäße Lagerung und Identifizierung von Bodenproben ist von entscheidender Bedeutung. Informationen über Breitengrad, Längengrad, Bodentyp und Biom …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil vom Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Projektnummer E-26/010.001993/2015) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) aus Brasilien finanziert.
Materials
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
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