הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.
Abstract
ביטוי הטרולוגי של קונקסינים ופונקסינים בביציות קסנופוס הוא גישה רבת עוצמה לחקר התכונות הביופיזיות של צמתי פער (GJs). עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שהיא דורשת מהדק מתח דיפרנציאלי של שתי ביציות מנוגדות החולקות מכנה משותף. למרות שמספר קטן של מעבדות הצליחו לבצע טכניקה זו, למעשה כולן השתמשו במגברים תוצרת בית או במגברים מסחריים שנועדו להקלטות של ביצית בודדת. לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אחרות ליישם טכניקה זו. למרות שמצב מדידת זרם צד גבוה שולב במגבר מסחרי להקלטות של מהדקי מתח ביציות כפולים, לא היה שום דיווח על יישומו עד למחקר האחרון שלנו. הפכנו את גישת מדידת הזרם הגבוה למעשית ונוחה יותר על ידי הכנסת מספר שינויים טכניים, כולל בניית פלטפורמת הקלטה מבוססת מגנטית המאפשרת מיקום מדויק של ביציות ואלקטרודות שונות, שימוש בתמיסת האמבטיה כמוליכה באלקטרודות דיפרנציאליות מתח, אימוץ אלקטרודת KCl מסחרית עם דליפה נמוכה כאלקטרודת הייחוס, ייצור אלקטרודות זרם ומתח מנימי זכוכית בעלי דופן דקה, ומיקום של כל האלקטרודות באמצעות מכשירים מבוססי מגנטים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הקלטות נוחות וחזקות של זרם צומתי (Ij) בין שתי ביציות קסנופוס מנוגדות.
Introduction
GJs הם תעלות בין-תאיות שעשויות לאפשר זרימה והחלפה של זרם של מולקולות ציטוזוליות קטנות בין תאים שכנים. הם קיימים בסוגי תאים רבים ומבצעים תפקודים פיזיולוגיים מגוונים. GJs אצל בעלי חוליות נוצרים על ידי connexins, ואילו אלה של חסרי חוליות על ידי innexins. כל GJ מורכב משני המיכנלים עם 6 או 8 תת-יחידות לכל המיקנל, תלוי אם הם קונקסינים או innexins 1,2,3. לבני אדם יש 21 גנים של קונקסין4, בעוד שלדגמים הנפוצים של חסרי חוליות C. elegans ו– Drosophila melanogaster יש 25 ו-8 גנים של innexin, בהתאמה 5,6. שחבור חלופי של תעתיקי גנים עשוי להגדיל עוד יותר את המגוון של חלבוני GJ, לפחות עבור innexins 7,8.
ניתן לחלק את ה-GJs לשלוש קטגוריות המבוססות על הרכבים מולקולריים: הומוטיפיים, הטרוטיפיים והטרומריים. ל-GJ הומוטיפי כל תת-היחידות שלו זהות. ל-GJ הטרוטיפי יש שני המיכנלים הומומריים, אך שני ההמיכנלים נוצרים על ידי שני חלבוני GJ שונים. GJ הטרומרי מכיל לפחות ההמיכנל ההטרומרי אחד. הגיוון המולקולרי של GJs עשוי להעניק תכונות ביופיזיות מובהקות החשובות לתפקודים הפיזיולוגיים שלהם. תכונות ביופיזיות של GJ מווסתות גם על ידי חלבונים רגולטוריים9. כדי להבין כיצד GJs מבצעים את התפקודים הפיזיולוגיים שלהם, חשוב לדעת את ההרכבים המולקולריים שלהם, את התכונות הביופיזיות שלהם ואת התפקידים של חלבונים רגולטוריים בתפקודים שלהם.
מערכות ביטוי הטרולוגיות משמשות לעתים קרובות לחקר תכונות ביופיזיות של תעלות יונים, כולל GJs, ואת ההשפעות של חלבונים רגולטוריים עליהם. מאחר שמערכות ביטוי הטרולוגיות מאפשרות ביטוי של חלבונים ספציפיים, הן בדרך כלל נוחות יותר לניתוח פונקציות חלבונים מאשר רקמות מקומיות שבהן חלבונים עם פונקציות יתירות יכולות לסבך את הניתוח, ורישום של Ij יכול להיות בלתי ניתן להשגה. למרבה הצער, קווי התאים הנפוצים ביותר למעט התא Neuro-2A אינם מתאימים לחקר תכונות ביופיזיות של GJ עקב סיבוכים של קונקסינים אנדוגניים. אפילו תאי Neuro-2A לא תמיד מתאימים לניתוח מסוג זה. לדוגמה, לא הצלחנו לזהות כל Ij בתאי Neuro-2A שעברו טרנספקציה עם innexins UNC-7 ו- UNC-9 בהיעדר או בנוכחות של UNC-1 (לא פורסם), הנדרש לתפקוד של UNC-9 GJs ב– C. elegans 9,10. מצד שני, ביציות קסנופוס הן מערכת חלופית שימושית לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים של GJs. למרות שהם מבטאים חלבון GJ אנדוגני, connexin 38 (Cx38)11, סיבוכים פוטנציאליים ניתן להימנע בקלות על ידי הזרקת אנטיסנס ספציפי oligonucleotide12. עם זאת, ניתוחים של GJs עם ביציות קסנופוס דורשים מהדק מתח דיפרנציאלי של שני תאים מעוותים, וזה מאתגר מבחינה טכנית. ההצלחות המוקדמות ביותר של מהדק מתח כפול של בלסטומרים של צפרדעים דווחו לפני כ-40 שנהלפני כ-13,14 שנה. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקה זו כדי לתעד את Ij בביציות קסנופוס מזווגות. עם זאת, למעשה כל המחקרים הקודמים בוצעו עם מגברים תוצרת בית12,15,16 או מגברים מסחריים המיועדים להקלטות על ביציות בודדות (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, או AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . מכיוון שאפילו המגברים המסחריים אינם מספקים הוראות למהדק מתח ביציות כפול, לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אלקטרופיזיולוגיות חדשות או פחות מתוחכמות ליישם טכניקה זו.
רק מגבר מסחרי אחד פותח עבור מהדק מתח ביציות כפול, ה-OC-725C ממכשירי וורנר (טבלת חומרים, איור 1A). ניתן להשתמש במגבר זה במצב סטנדרטי (עבור ביציות בודדות) או במצב מדידת זרם צד גבוה (עבור ביציות בודדות או כפולות), תלוי אם שני שקעים בבדיקת המתח שלו מחוברים (איור 1B, C). עם זאת, עד למחקר האחרון שלנו7, לא היה פרסום אחד המתאר את השימוש במגבר זה במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו. למרות שהמגבר שימש מעבדה אחרת להקלטות של שתי ביציות, הוא שימש בתקן ולא במצב הצד הגבוה21,22. היעדר דיווחים זה באמצעות המגבר במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו עשוי לנבוע מקשיים טכניים. לא הצלחנו להשיג הקלטות יציבות של שתי ביציות באמצעות מצב הצד הגבוה על ידי ביצוע הוראות היצרן. במהלך השנים, ניסינו שלוש גישות שונות לרישומי ביציות כפולות, כולל שימוש בשני מגברי OC-725C במצב מדידת זרם צד גבוה, שני מגברי OC-725C במצב סטנדרטי ושני מגברים מיצרן אחר. בסופו של דבר הצלחנו להשיג הקלטות יציבות רק בגישה הראשונה לאחר ניסוי וטעייה נרחבים. פרסום זה מתאר ומדגים את ההליכים בהם אנו משתמשים כדי לבטא חלבוני GJ בביציות קסנופוס, לרשום Ij באמצעות מצב מדידת הזרם הגבוה, ולנתח את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים באמצעות תוכנה מסחרית פופולרית. מידע נוסף על טכניקת הידוק המתח הכפול ניתן למצוא בפרסומים אחרים19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
נראה כי אופטימיזציה של המערכת נחוצה לניסויים כפולים של מהדקי מתח ביציות. בלעדיו, הקלטות יכולות להיות מאוד לא יציבות, וייתכן שהמגברים יצטרכו להזריק כמות מופרזת של זרם כדי להגיע למטרה Vm, וכתוצאה מכך לגרום לנזק לביציות ולכשלים ברישום. מספר גורמים הם קריטיים להשגת רישומי ביציות כפולות יצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להייינג ג’ן, צ’יאן גה על מעורבותם בשלב הראשוני של הפיתוח הטכני, לקיראנמאיי ודנת’ם על העזרה עם הדמויות, ולד”ר קמילו פראצ’יה על הייעוץ בנוגע לתא זיווג הביציות.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologie du développement. 156 (2), 490-499 (1993).
