Запись тока перехода разрыва от ооцитов Ксенопуса
Summary
Здесь мы представляем протокол для экспрессии белков щелевого перехода в ооцитах Xenopus и регистрации соединительного тока между двумя аппозированными ооцитами с использованием коммерческого усилителя, предназначенного для двойной записи напряжения-зажима ооцитов в режиме измерения высокого бокового тока.
Abstract
Гетерологичная экспрессия коннексинов и иннексинов в ооцитах Xenopus является мощным подходом к изучению биофизических свойств щелевых соединений (ГДЖ). Однако этот подход является технически сложным, поскольку он требует дифференциального напряжения зажима двух противоположных ооцитов, имеющих общую основу. Хотя небольшое количество лабораторий преуспели в выполнении этой техники, по сути, все они использовали либо самодельные усилители, либо коммерческие усилители, которые были разработаны для записи одиночных ооцитов. Другим лабораториям часто сложно реализовать этот метод. Хотя режим измерения высокого бокового тока был включен в коммерческий усилитель для записи двойного напряжения и зажима ооцитов, до нашего недавнего исследования не было отчета о его применении. Мы сделали подход к измерению высокого бокового тока более практичным и удобным, внедрив несколько технических модификаций, включая конструкцию магнитофонной записывающей платформы, которая позволяет точно размещать ооциты и различные электроды, использование раствора ванны в качестве проводника в дифференциальных электродах напряжения, принятие коммерческого электрода KCl с низкой утечкой в качестве электрода сравнения, изготовление электродов тока и напряжения из тонкостенных стеклянных капилляров и позиционирование всех электродов с помощью устройств на магнитной основе. Метод, описанный здесь, позволяет удобно и надежно регистрировать соединительный ток (Ij) между двумя противоположными ооцитами Xenopus .
Introduction
GJ представляют собой межклеточные каналы, которые могут обеспечивать токовый поток и обмен небольшими цитозольными молекулами между соседними клетками. Они существуют во многих типах клеток и выполняют разнообразные физиологические функции. GJ у позвоночных образуются коннексинами, тогда как у беспозвоночных — иннексинами. Каждый GJ состоит из двух сопоставленных гемиханнелей с 6 или 8 субъединицами на гемичаннель, в зависимости от того, являются ли они коннексинами или иннексинами 1,2,3. Люди имеют 21 ген коннексина4, в то время как обычно используемые модели беспозвоночных C. elegans и Drosophila melanogaster имеют 25 и 8 генов инксина соответственно 5,6. Альтернативное сплайсинг транскриптов генов может еще больше увеличить разнообразие белков GJ, по крайней мере, для иннексинов 7,8.
GJ можно разделить на три категории на основе молекулярных композиций: гомотипические, гетеротипические и гетеромерные. Гомотипический GJ имеет все свои субъединицы идентичны. Гетеротипический GJ имеет два гомомерных гемиханнеля, но два гемиханнеля образованы двумя разными белками GJ. Гетеромерный GJ содержит, по меньшей мере, один гетеромерный гемичаннель. Молекулярное разнообразие ГЮ может придавать различные биофизические свойства, которые важны для их физиологических функций. Биофизические свойства GJ также модулируются регуляторными белками9. Чтобы понять, как GJ выполняют свои физиологические функции, важно знать их молекулярный состав, биофизические свойства и роль регуляторных белков в их функциях.
Гетерологичные системы экспрессии часто используются для изучения биофизических свойств ионных каналов, включая GJ, и влияния на них регуляторных белков. Поскольку гетерологичные системы экспрессии позволяют экспрессировать специфические белки, они, как правило, более поддаются препарированию белковых функций, чем нативные ткани, где белки с избыточными функциями могут усложнить анализ, а запись Ij может быть недостижимой. К сожалению, наиболее часто используемые клеточные линии, за исключением клетки Neuro-2A, не подходят для изучения биофизических свойств GJ из-за осложнений эндогенными коннексинами. Даже клетки Neuro-2A не всегда подходят для такого рода анализа. Например, мы не смогли обнаружить I j в клетках Neuro-2A, трансфектированных иннексинами UNC-7 и UNC-9 ни при отсутствии, ни при наличии UNC-1 (неопубликованного), который необходим для функции UNC-9 GJ в C. elegans 9,10. С другой стороны, ооциты Xenopus являются полезной альтернативной системой для электрофизиологического анализа GJ. Хотя они экспрессируют эндогенный белок GJ, коннексин 38 (Cx38)11, потенциальных осложнений можно легко избежать, введя специфический антисмысловой олигонуклеотид12. Тем не менее, анализы GJ с ооцитами Xenopus требуют дифференциального напряжения зажима двух сопоставленных клеток, что технически сложно. О самых ранних успехах двойного напряжения зажима лягушачьих бластомеров сообщалось около 40 лет назад13,14. С тех пор многие исследования использовали эту технику для записи Ij в парных ооцитах Xenopus. Однако практически все предыдущие исследования проводились либо с самодельными усилителями 12,15,16, либо с коммерческими усилителями, предназначенными для записи на одиночных ооцитах (GeneClamp 500, AxoClamp 2A или AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Поскольку даже коммерческие усилители не предоставляют инструкций для зажима двойного напряжения ооцитов, новым или менее сложным электрофизиологическим лабораториям часто сложно реализовать этот метод.
Только один коммерческий усилитель был разработан для двойного зажима напряжения ооцитов, OC-725C от Warner Instruments (Таблица материалов, рисунок 1A). Этот усилитель может быть использован либо в стандартном режиме (для одиночных ооцитов), либо в режиме измерения тока высокой стороны (для одиночных или двойных ооцитов) в зависимости от того, подключены ли две розетки в его датчике напряжения (фиг.1B, C). Однако до нашего недавнего исследования7 не было ни одной публикации, описывающей использование этого усилителя в режиме измерения тока высокой стороны. Хотя усилитель использовался другой лабораторией для записи двойных ооцитов, он использовался в стандартном, а не в высоком боковом режиме21,22. Это отсутствие отчетов с использованием усилителя в режиме измерения тока с высокой стороной может быть связано с техническими трудностями. Мы не смогли получить стабильные записи двойных ооцитов в режиме высокой стороны, следуя инструкциям производителя. На протяжении многих лет мы пробовали три различных подхода к записи двойных ооцитов, в том числе с использованием двух усилителей OC-725C в режиме измерения тока высокой стороны, двух усилителей OC-725C в стандартном режиме и двух усилителей от другого производителя. В конце концов нам удалось получить стабильные записи только при первом подходе после обширных проб и ошибок. Эта публикация описывает и демонстрирует процедуры, которые мы используем для экспрессии белков GJ в ооцитах Xenopus, записи Ij с использованием режима измерения тока высокой стороны и анализа электрофизиологических данных с использованием популярного коммерческого программного обеспечения. Дополнительную информацию о технике двойного напряжения-зажима можно найти в других публикациях19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимизация системы, по-видимому, необходима для экспериментов с двойным напряжением и зажимом ооцитов. Без него записи могут быть очень нестабильными, и усилителям, возможно, придется вводить чрезмерное количество тока, чтобы достичь целевого Vm, что приводит к повреждению ооцито?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Хайин Чжань, Цянь Гэ за их участие в начальной стадии технического развития, Киранмайи Ведантама за помощь с цифрами и доктора Камилло Пераккья за советы по камере спаривания ооцитов.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologie du développement. 156 (2), 490-499 (1993).
