Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes
Summary
Le taux de consommation d’oxygène (OCR) est un indicateur commun de la fonction mitochondriale et peut être utilisé pour étudier différents modèles de maladie. Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes qui est plus pertinente physiologiquement que d’autres méthodes.
Abstract
Les mitochondries jouent un rôle important dans la production cellulaire d’ATP, la régulation des espèces réactives de l’oxygène etle contrôle de la concentration de Ca 2 +. Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans la pathogenèse de multiples maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Pour étudier le rôle des mitochondries dans les modèles de ces maladies, nous pouvons mesurer la respiration mitochondriale via le taux de consommation d’oxygène (OCR) comme proxy de la fonction mitochondriale. L’OCR a déjà été mesurée avec succès dans des cultures cellulaires, ainsi que dans des mitochondries isolées. Cependant, ces techniques sont moins pertinentes physiologiquement que la mesure de l’OCR dans les tranches de cerveau aiguës. Pour surmonter cette limitation, les auteurs ont développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes. La technique est optimisée en mettant l’accent sur le striatum, une zone du cerveau impliquée dans la MP et la maladie de Huntington. L’analyseur effectue un test de cellules vivantes à l’aide d’une plaque de 24 puits, ce qui permet la mesure cinétique simultanée de 24 échantillons. La méthode utilise des morceaux perforés circulairement de tranches cérébrales striatales comme échantillons. Nous démontrons l’efficacité de cette technique en identifiant une OCR basale inférieure dans des tranches striatales d’un modèle murin de MP. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la MP et de la maladie de Huntington.
Introduction
Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer 1,2,3. Les modèles tels que les souris et les rats PINK1 knockout (KO) présentent une altération de la fonction mitochondriale 4,5,6,7,8,9,10,11. Les mitochondries isolées du striatum (STR) ou du cerveau entier d’une souris ROSE1 KO âgée présentent des défauts dans le complexe I 7,10,12,13. La mesure directe du taux de consommation d’oxygène (OCR) est l’une des méthodes les plus courantes pour évaluer la fonction mitochondriale puisque l’OCR est couplée à la production d’ATP, la fonction principale des mitochondries14. Par conséquent, la mesure de l’OCR dans des modèles de maladie ou des échantillons / tissus dérivés du patient peut aider à étudier comment le dysfonctionnement mitochondrial conduit à la maladie.
Actuellement, il existe plusieurs façons de mesurer l’OCR mitochondriale, y compris l’électrode Clark et d’autresélectrodes O2, le colorant fluorescent O 2 et l’analyseur de flux extracellulaire 15,16,17,18,19. En avantage, les méthodes à base d’électrodes O2 permettent d’ajouter facilement divers substrats. Cependant, ils sont insuffisants pour mesurer simultanément plusieurs échantillons. Par rapport aux méthodestraditionnelles à base d’électrodes O 2, l’analyseur de flux extracellulaire, un outil couramment utilisé pour l’OCR dans les cultures cellulaires ou les mitochondries purifiées, offre un débit amélioré de 15,18,20. Néanmoins, toutes ces méthodes sont généralement appliquées pour mesurer l’OCR dans des mitochondries isolées ou des cultures cellulaires 6,16,17,19,20,21. L’isolement des mitochondries cause des dommages par inadvertance, et les mitochondries extraites ou les cultures cellulaires sont moins pertinentes physiologiquement que les tranches de cerveau intactes22. Même lorsque les microélectrodes sont utilisées en tranches, elles sont moins sensibles et plus difficiles à utiliser que dans les cellules cultivées23.
Pour relever ces défis, nous avons développé une méthode utilisant l’analyseur de flux extracellulaire XF24, qui permet d’analyser plusieurs paramètres métaboliques à partir de tranches cérébrales striatales aiguës de souris24. Cette technique fournit une quantification directe continue de la respiration mitochondriale via l’OCR. En bref, de petites sections de tranches cérébrales striatales sont placées dans des puits de la plaque d’îlot, et l’analyseur utilise des biocapteurs fluorescents à base d’oxygène et de protons pour mesurer l’OCR et le taux d’acidification extracellulaire, respectivement 17,21,25.
L’une des caractéristiques uniques de l’analyseur est les quatre puits d’injection, qui permettent la mesure continue de l’OCR tout en injectant séquentiellement jusqu’à quatre composés ou réactifs; cela permet de mesurer plusieurs paramètres de respiration cellulaire, tels que l’OCR mitochondriale basale, l’OCR liée à l’ATP et l’OCR mitochondriale maximale. Les composés injectés lors des mesures pour le protocole montrés ici étaient des concentrations de travail de 10 mM de pyruvate dans le puits de la première solution (port A), de 20 μM d’oligomycine dans le puits de la deuxième solution (port B), de 10 μM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans le troisième puits (port C) et de 20 μM d’antimycine A dans le quatrième puits (port D), d’après Fried et al.25. Il convient de noter que ces concentrations étaient des concentrations de travail et que des solutions mères de 10x, 11x, 12x et 13x ont été injectées dans les ports de solution A à D, respectivement. Le but de l’utilisation de chaque solution était le suivant: 1) Le pyruvate était nécessaire car, sans lui, l’ajout de FCCP aurait une réponse OCR diminuée causée par une limitation des substrats disponibles; 2) L’oligomycine inhibe l’ATP synthase et permet de mesurer la respiration liée à l’ATP; 3) FCCP découple l’oxydation de la phosphorylation et permet la mesure de la capacité mitochondriale maximale; 4) L’antimycine A inhibe le complexe III dans la chaîne de transport d’électrons et, par conséquent, permet la mesure de l’OCR non liée aux mitochondries.
La concentration d’oligomycine utilisée a été déterminée pour les raisons suivantes : 1) La dose recommandée d’oligomycine pour la plupart des types de cellules (mitochondries isolées ou cultures cellulaires) est de 1,5 μM. D’après l’expérience, généralement 3x-10x de la dose de cellules dissociées est utilisée pour les expériences de tranches, car il peut y avoir un gradient et la pénétration de la solution dans les tranches prend du temps. Par conséquent, la concentration doit être comprise entre 5 μM et 25 μM. 2) Une concentration de 20 μM a été choisie sur la base de Fried et al.25. Des concentrations plus élevées n’ont pas été essayées en raison de la toxicité non spécifique de l’olélicine. 3) Dans le rapport d’Underwood et al.26, les auteurs ont fait une expérience de titrage pour l’oligomycine et ont constaté que des doses de 6,25, 12,5, 25 et 50 μg / mL entraînaient une inhibition similaire. La concentration plus élevée d’oligomycine (50 μg/mL) n’a pas inhibé davantage, mais a eu une plus grande variance. 4) Dans notre observation, le facteur déterminant semble être la capacité de pénétration de l’olligomycine. Il est difficile pour l’oligomycine de pénétrer dans le tissu, et c’est pourquoi il faut au moins 7 à 8 cycles pour atteindre le plateau, la réponse maximale. Tant qu’il atteint le plateau, l’inhibition est supposée être maximale.
L’un des principaux défis techniques de l’adaptation de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer l’OCR dans les tranches striatales est de prévenir l’hypoxie tissulaire. Comme le tampon n’a pas été oxygéné pendant toute la durée des mesures (environ 4 h), l’hypoxie était un problème central. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de tissus plus épais, où l’oxygène ne peut pas diffuser dans les échantillons. Pour surmonter ce problème, des tranches ont été sectionnées à 150 μm d’épaisseur, de sorte que l’oxygène ambiant puisse pénétrer au milieu des tranches de cerveau. De plus, 4 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) ont été ajoutés au tampon du liquide céphalo-rachidien artificiel préoxygéné (ACSF), ce qui a facilité la détermination de l’OCR maximale, comme suggéré précédemment23. Nous avons examiné si les cellules étaient vivantes. Tout d’abord, Hoechst 33258 (10 μM) et l’iodure de propidium (10 μM) ont été utilisés pour examiner si les cellules étaient saines dans ces conditions. Nous avons ensuite examiné si les neurones épineux moyens étaient fonctionnellement sains à l’aide de l’enregistrement patch-clamp. Nous avons ensuite évalué si les terminaux dopaminergiques (DA) dans les tranches striatales étaient fonctionnellement sains en mesurant la libération de DA à l’aide de la voltampérométrie à balayage rapide. Les résultats ont montré que les tranches striatales qui n’étaient pas oxygénées (groupe ACSF/BSA) étaient aussi saines que le groupe témoinoxygéné 24.
Nous avons ensuite testé différentes combinaisons d’épaisseur de tranche et de taille de poinçon pour déterminer les conditions optimales de la tranche striatale pour le test de respiration de flux. Des tranches striatales dorsales de différentes épaisseurs (150 μm et 200 μm) et de différentes tailles de poinçonnage (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) ont été utilisées pour l’analyse OCR à l’aide de l’analyseur. Les tranches striatales de 150 μm d’épaisseur avec une taille de poinçon de 1,5 mm de diamètre avaient l’efficacité de couplage la plus élevée et des OCR dans une plage optimale pour l’analyseur24.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode que nous avons développée a permis d’utiliser un analyseur XF pour mesurer l’OCR dans des tranches striatales de souris adultes sur une période de 4 h. Cette méthode offre une nouvelle façon de mesurer la bioénergétique cellulaire dans les poinçons excisés à partir de structures cérébrales anatomiquement définies. Étant donné que les échantillons de tissus analysés sont plutôt petits, les paramètres métaboliques de zones cérébrales spécifiques impliquées dans une maladie peuvent ê…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Wangchen Tsering et Pamela Walter pour leur lecture critique et leur édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 à C.J. L. et NS098393 à H.Z.) et le Département de neurosciences de l’Université Thomas Jefferson (Startup Funds à H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
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