Den nuværende protokol beskriver trinvise retningslinjer for RNAi-operationsteknikkerne i P. americana.
Kakerlakker, et sanitært skadedyr, er vigtige arter i insektudviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser på grund af deres lette fodring og hemimetaboløse egenskaber. Alt i alt med velkommenterede genomsekvenser har disse fordele gjort amerikansk kakerlak, Periplaneta americana, til en vigtig hemimetaboløs insektmodel. Begrænset af manglen på knockout-strategi bliver effektiv RNA-interferens (RNAi)-baseret gennedslag en uundværlig teknik i funktionel genforskning af P. americana. Den nuværende protokol beskriver RNAi-operationsteknikkerne i P. americana. Protokollen omfatter (1) udvælgelse af P. americana på korrekte udviklingsstadier, (2) forberedelse til injektionsindstillingen, (3) dsRNA-injektion og (4) påvisning af gennedslagseffektivitet. RNAi er et kraftfuldt omvendt genetisk værktøj i P. americana. Størstedelen af P. americana-væv er følsomme over for ekstracellulært dsRNA. Dens enkelhed gør det muligt for forskere hurtigt at opnå dysfunktionelle fænotyper under en eller flere målrettede dsRNA-injektioner, hvilket gør det muligt for forskere bedre at bruge P. americana til udviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser.
RNA-interferens (RNAi), en evolutionært bevaret mekanisme, bliver gradvist et vigtigt omvendt genetisk værktøj til at hæmme genekspression i mange organismer1, da Andrew Fire og Craig Mello2 udviklede den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) medierede gensindsigtsstrategi. dsRNA spaltes i fragmenter af 21-23 nukleotider, små interfererende RNA’er (siRNA’er), af enzymet Dicer i celler for at aktivere RNAi-vejen. Derefter inkorporeres siRNA’er i det RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC), som kobles til mål-mRNA’et, forårsager mRNA-spaltning og resulterer til sidst i tab af genfunktion 3,4,5. Blandt insektarterne er mange systemiske RNAi-eksperimenter hidtil blevet rapporteret i masser af insektordrer, såsom Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera og Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlakker (Blattaria) er en essentiel insektfamilie i udviklingsmæssige og metamorfe studier med deres hurtige vækstcyklusser, stærke tilpasningsevne til miljøet og høj udviklingsmæssig plasticitet9. Før man opdagede, at RNAi var kompatibel med kakerlakker, fokuserede tidligere forskning kun på kakerlakforebyggelse og -kontrol på grund af mangel på genetiske manipulationsteknikker i kakerlakker. Kakerlak oothecas unikke struktur gjorde det udfordrende at udføre embryoinjektionsbaseret genknockout med CRISPR-Cas9-systemet. Desuden viser de fleste væv i kakerlakker (såsom P. americana) robust systemisk RNAi-respons, hvilket muliggør hurtig generering af dysfunktionelle fænotyper ved at injicere en eller flere målrettede dsRNA’er 9,10,11. Disse funktioner gjorde RNAi til en uundværlig teknik inden for genfunktionel forskning i P. americana.
Selvom brugen af RNAi i funktionel genforskning i P. americana er blevet rapporteret, var der ingen detaljeret eller trinvis beskrivelse tilgængelig. Denne rapport giver en trinvis operationel retningslinje for RNAi i P. americana, der er nyttig til genfunktionsundersøgelse i andre kakerlakker. Desuden er denne vejledning ikke begrænset til Blattodea og kan anvendes på mange andre insekter med mindre ændringer.
Denne rapport beskrev en metodologisk trin-for-trin RNAi-strategi i P. americana; Bemærk, at det også kan anvendes på andre kakerlakker (f.eks. Blattella germanica ) og mange andre insekter med mindre ændringer. RNAi’s genhæmningseffektivitet er imidlertid ikke altid høj nok, med en åbenlys ulempe sammenlignet med genknockout-strategien13. Følgende restvirkning af genniveau kan forstyrre de reelle fænotyper. For at sikre, at RNAi-behandlingen er vellykket, skal flere væ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 og 31572325 til C.R., Sh.L.), af Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 og 2020A1515011267 til C.R.), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangdong-provinsen (Grant Nos. 2019B090905003 og 2019A0102006), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangzhou (Grant No. 202102020110), af Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 til Sh.L.).
701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |