अमेरिकी तिलचट्टा में आरएनए हस्तक्षेप के अनुप्रयोग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल पी. अमेरिकाना में आरएनएआई ऑपरेशन तकनीकों के लिए चरण-दर-चरण दिशानिर्देशों का वर्णन करता है।
Abstract
कॉकरोच, एक सैनिटरी कीट, कीट विकास और मेटामॉर्फिक अध्ययनों में आवश्यक प्रजातियां हैं क्योंकि उनके आसान भोजन और हेमीमेटाबोलस विशेषताओं के कारण। पूरी तरह से अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम अनुक्रमों के साथ, इन फायदों ने अमेरिकी तिलचट्टा, पेरिप्लेनेटा अमेरिकाना, एक महत्वपूर्ण हेमीमेटाबोलस कीट मॉडल बना दिया है। नॉकआउट रणनीति की कमी से सीमित, प्रभावी आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) -आधारित जीन नॉकडाउन पी अमेरिकाना के कार्यात्मक जीन अनुसंधान में एक अपरिहार्य तकनीक बन जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल पी. अमेरिकाना में आरएनएआई ऑपरेशन तकनीकों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में (1) उचित विकास चरणों में पी. अमेरिकाना का चयन, (2) इंजेक्शन सेटिंग के लिए तैयारी, (3) डीएसआरएनए इंजेक्शन, और (4) जीन नॉकडाउन दक्षता का पता लगाना शामिल है। आरएनएआई पी अमेरिकाना में एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक उपकरण है। पी. अमेरिकाना ऊतकों के बहुमत extracellular dsRNA के प्रति संवेदनशील हैं। इसकी सादगी शोधकर्ताओं को एक या कई लक्ष्यीकरण डीएसआरएनए इंजेक्शन के तहत जल्दी से बेकार फेनोटाइप प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिससे शोधकर्ताओं को विकासात्मक और रूपांतरित अध्ययनों के लिए पी. अमेरिकाना का बेहतर उपयोग करने में सक्षम बनाया जा सकता है।
Introduction
आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), एक विकासवादी रूप से संरक्षित तंत्र, धीरे-धीरे कई जीवों में जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक आवश्यक रिवर्स-आनुवंशिक उपकरण बन जाताहै 1, क्योंकि एंड्रयू फायर और क्रेग मेलो2 ने डबल-फंसे हुए आरएनए (डीएसआरएनए) मध्यस्थता जीन चुप्पी रणनीति विकसित की। dsRNA को 21-23 न्यूक्लियोटाइड्स, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (siRNAs) के टुकड़ों में विभाजित किया जाता है, जो आरएनएआई मार्ग को सक्रिय करने के लिए कोशिकाओं में एंजाइम डाइसर द्वारा होता है। फिर siRNAs को आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (RISC) में शामिल किया जाता है, जो लक्ष्य mRNA के लिए जोड़ता है, mRNA दरार का कारण बनता है, और अंत में जीन फ़ंक्शन 3,4,5 के नुकसान में परिणाम देता है। कीट प्रजातियों में, कई प्रणालीगत आरएनएआई प्रयोगों को अब तक बहुत सारे कीट आदेशों में सूचित किया गया है, जैसे कि ऑर्थोप्टेरा, आइसोप्टेरा, हेमिप्टेरा, कोलिओप्टेरा, न्यूरोप्टेरा, डिप्टेरा, हाइमेनोप्टेरा, लेपिडोप्टेरा, और ब्लैटोडिया 5,6,7,8।
कॉकरोच (ब्लैटेरिया) विकासात्मक और रूपांतरित अध्ययनों में एक आवश्यक कीट परिवार हैं, जिसमें उनके तेजी से विकास चक्र, पर्यावरण के लिए मजबूत अनुकूलन क्षमता और उच्च विकासात्मक प्लास्टिसिटी9 है। यह पता लगाने से पहले कि आरएनएआई तिलचट्टे के साथ संगत था, पिछले शोध ने केवल तिलचट्टे में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों की कमी के कारण तिलचट्टे की रोकथाम और नियंत्रण पर ध्यान केंद्रित किया था। कॉकरोच ऊथेका की अद्वितीय संरचना ने CRISPR-Cas9 प्रणाली के साथ भ्रूण इंजेक्शन-आधारित जीन नॉकआउट करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना दिया। इसके अलावा, तिलचट्टे में अधिकांश ऊतक (जैसे पी. अमेरिकाना) मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं, जो एक या अधिक लक्ष्यीकरण dsRNAs 9,10,11 को इंजेक्ट करके बेकार फेनोटाइप की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। इन विशेषताओं ने आरएनएआई को पी. अमेरिकाना में जीन कार्यात्मक अनुसंधान में एक अपरिहार्य तकनीक बना दिया।
भले ही पी. अमेरिकाना में कार्यात्मक जीन अनुसंधान में आरएनएआई के उपयोग की सूचना दी गई है, कोई विस्तृत या चरण-दर-चरण विवरण उपलब्ध नहीं था। यह रिपोर्ट पी. अमेरिकाना में आरएनएआई के लिए एक चरण-दर-चरण परिचालन दिशानिर्देश प्रदान करती है, जो अन्य तिलचट्टे में जीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, यह मार्गदर्शिका ब्लैटोडिया तक सीमित नहीं है और मामूली संशोधनों के साथ कई अन्य कीड़ों पर लागू की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में पी. अमेरिकाना में एक पद्धतिगत चरण-दर-चरण आरएनएआई रणनीति का वर्णन किया गया है; ध्यान दें, यह भी अन्य तिलचट्टे (Blattella germanica, उदाहरण के लिए) और मामूली परिवर्तन के साथ कई अन्य कीड़ों के लिए ला?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 32070500, 31620103917, 31330072, और C.R., Sh.L.) के लिए 31572325 द्वारा समर्थित किया गया था, गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2021B1515020044 और 2020A1515011267 को C.R.), गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान 202102020110 संख्या 201515011267) द्वारा, गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान संख्या 201515011267) द्वारा, गुआंग्डोंग प्रांत में विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा (अनुदान संख्या 201909000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा (अनुदान सं। KQTD20180411143628272 करने के लिए Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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