Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano
Summary
Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.
Abstract
Gli scarafaggi, un parassita sanitario, sono specie essenziali negli studi sullo sviluppo degli insetti e metamorfici grazie alla loro facile alimentazione e alle caratteristiche emimetaboliche. Complessivamente con sequenze di genoma ben annotate, questi vantaggi hanno reso lo scarafaggio americano, Periplaneta americana, un importante modello di insetto emimetabolico. Limitato dalla carenza di strategia di knockout, l’efficace knockdown genico basato sull’interferenza dell’RNA (RNAi) diventa una tecnica indispensabile nella ricerca genica funzionale di P. americana. Il presente protocollo descrive le tecniche di funzionamento RNAi in P. americana. Il protocollo include (1) la selezione della P. americana nelle fasi di sviluppo appropriate, (2) la preparazione per l’impostazione dell’iniezione, (3) l’iniezione di dsRNA e (4) il rilevamento dell’efficienza del knockdown genico. RNAi è un potente strumento genetico inverso in P. americana. La maggior parte dei tessuti di P. americana sono sensibili al dsRNA extracellulare. La sua semplicità consente ai ricercatori di ottenere rapidamente fenotipi disfunzionali sotto una o più iniezioni di dsRNA, consentendo ai ricercatori di utilizzare meglio il P. americana per studi di sviluppo e metamorfici.
Introduction
L’interferenza dell’RNA (RNAi), un meccanismo conservato evolutivamente, diventa gradualmente uno strumento genetico inverso essenziale per inibire l’espressione genica in molti organismi1, da quando Andrew Fire e Craig Mello2 hanno sviluppato la strategia di silenzio genico mediato dall’RNA a doppio filamento (dsRNA). Il dsRNA viene scisso in frammenti di 21-23 nucleotidi, piccoli RNA interferenti (siRNA), dall’enzima Dicer nelle cellule per attivare la via dell’RNAi. Quindi i siRNA vengono incorporati nel complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC), che si accoppia all’mRNA bersaglio, provoca la scissione dell’mRNA e infine provoca la perdita della funzione genica 3,4,5. Tra le specie di insetti, molti esperimenti sistemici RNAi sono stati finora segnalati in molti ordini di insetti, come Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Ditteri, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
Gli scarafaggi (Blattaria) sono una famiglia di insetti essenziale negli studi sullo sviluppo e metamorfici con i loro rapidi cicli di crescita, la forte adattabilità all’ambiente e l’elevata plasticità dello sviluppo9. Prima di scoprire che l’RNAi era compatibile con gli scarafaggi, la ricerca precedente si è concentrata solo sulla prevenzione e il controllo degli scarafaggi a causa della scarsità di tecniche di manipolazione genetica negli scarafaggi. La struttura unica dell’ooteca scarafaggio ha reso difficile eseguire il knockout genetico basato sull’iniezione di embrioni con il sistema CRISPR-Cas9. Inoltre, la maggior parte dei tessuti negli scarafaggi (come P. americana) mostra una robusta risposta sistemica all’RNAi, consentendo la rapida generazione di fenotipi disfunzionali iniettando uno o più dsRNAmirati 9,10,11. Queste caratteristiche hanno reso l’RNAi una tecnica indispensabile nella ricerca funzionale genica in P. americana.
Anche se è stato riportato l’uso di RNAi nella ricerca sui geni funzionali in P. americana , non era disponibile alcuna descrizione dettagliata o dettagliata. Questo rapporto fornisce una linea guida operativa passo-passo per RNAi in P. americana, utile per lo studio della funzione genica in altri scarafaggi. Inoltre, questa guida non si limita a Blattodea e può essere applicata a molti altri insetti con piccole modifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto descriveva una strategia metodologica passo-passo RNAi in P. americana; da notare, può anche essere applicato ad altri scarafaggi (Blattella germanica, per esempio) e molti altri insetti con piccoli cambiamenti. Tuttavia, l’efficienza di silenziamento genico dell’RNAi non è sempre abbastanza elevata, con un evidente svantaggio rispetto alla strategia di knockout genico13. Il seguente effetto residuo del livello genico può interferire con i fenotipi reali. Per g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 e 31572325 a C.R., Sh.L.), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia nella Provincia del Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 e 2019A0102006), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (Grant No. 202102020110), dal Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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