Anvendelser av RNA Interference i amerikansk
Summary
Den nåværende protokollen beskriver trinnvise retningslinjer for RNAi-operasjonsteknikkene i P. americana.
Abstract
, et sanitært, er essensielle arter i insektutviklings- og metamorfiske studier på grunn av deres enkle fôring og hemimetabolske egenskaper. Til sammen med godt kommenterte genomsekvenser har disse fordelene gjort amerikansk, Periplaneta americana, en viktig hemimetabolsk insektmodell. Begrenset av mangelen på knockout strategi, effektiv RNA interferens (RNAi)-basert gen knockdown blir en uunnværlig teknikk i funksjonell genforskning av P. americana. Den nåværende protokollen beskriver RNAi operasjonsteknikker i P. americana. Protokollen inkluderer (1) valg av P. americana på riktige utviklingsstadier, (2) forberedelse til injeksjonsinnstillingen, (3) dsRNA-injeksjon og (4) gen knockdown effektivitetsdeteksjon. RNAi er et kraftig omvendt genetisk verktøy i P. americana. De fleste P. americana vev er følsomme for ekstracellulær dsRNA. Dens enkelhet gjør det mulig for forskere å raskt få dysfunksjonelle fenotyper under en eller flere målretting dsRNA injeksjoner, slik at forskere bedre kan bruke P. americana for utviklings- og metamorfiske studier.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolusjonært bevart mekanisme, blir gradvis et viktig omvendt genetisk verktøy for å hemme genuttrykk i mange organismer1, siden Andrew Fire og Craig Mello2 utviklet den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) medierte gentaushetsstrategien. dsRNA er spaltet inn i fragmenter av 21-23 nukleotider, små forstyrrende RNAer (siRNAer), av enzymet Dicer i celler for å aktivere RNAi-banen. Deretter blir siRNAer innlemmet i det RNA-induserte silencingkomplekset (RISC), som par til målet mRNA, forårsaker mRNA-spalting, og til slutt resulterer i tap av genfunksjon 3,4,5. Blant insektsartene har mange systemiske RNAi-eksperimenter så langt blitt rapportert i mange insektordrer, som Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera og Blattodea 5,6,7,8.
(Blattaria) er en viktig insektfamilie i utviklings- og metamorfiske studier med sine raske vekstsykluser, sterk tilpasningsevne til miljøet og høy utviklingsplastisitet9. Før du oppdager at RNAi var kompatibel med, fokuserte tidligere forskning bare på kakerlakkforebygging og kontroll på grunn av knapphet på genetiske manipulasjonsteknikker i. oothecas unike struktur gjorde det utfordrende å utføre embryoinjeksjonsbasert gen knockout med CRISPR-Cas9-systemet. Dessuten viser de fleste vev i (som P. americana) robust systemisk RNAi-respons, noe som gir rask generering av dysfunksjonelle fenotyper ved å injisere en eller flere målrettede dsRNAer 9,10,11. Disse funksjonene gjorde RNAi til en uunnværlig teknikk i genfunksjonell forskning i P. americana.
Selv om bruk av RNAi i funksjonell genforskning i P. americana er rapportert, var det ingen detaljert eller trinnvis beskrivelse tilgjengelig. Denne rapporten gir en trinnvis operasjonell retningslinje for RNAi i P. americana, nyttig for genfunksjonsstudie i andre. Videre er denne guiden ikke begrenset til Blattodea og kan brukes på mange andre insekter med mindre modifikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapporten beskrev en metodisk trinnvis RNAi-strategi i P. americana; Vær oppmerksom på at den også kan brukes på andre (for eksempel Blattella germanica ) og mange andre insekter med mindre endringer. Genaktiveringseffektiviteten til RNAi er imidlertid ikke alltid høy nok, med en åpenbar ulempe sammenlignet med gen knockout-strategien13. Følgende gjenværende effekt av gennivå kan forstyrre de virkelige fenotypene. For å sikre at RNAi-behandlingen er vellykket, må…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 og 31572325 til C.R., Sh.L.), av Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (Grant No. 2021B1515020044 og 2020A1515011267 til C.R.), av Institutt for vitenskap og teknologi i Guangdong-provinsen (Grant Nos. 2019B090905003 og 2019A0102006), av Institutt for vitenskap og teknologi i Guangzhou (Grant No. 202102020110), av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 til Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
