Aplicações de interferência de RNA na barata americana
Summary
O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.
Abstract
Baratas, uma praga sanitária, são espécies essenciais em estudos de desenvolvimento de insetos e metamórficos devido à sua fácil alimentação e características hemimetabólicas. Ao todo com sequências de genomas bem anotadas, essas vantagens fizeram da barata americana Periplaneta americana, um importante modelo de insetos hemimetados. Limitado pela escassez de estratégia de nocaute, o knockdown genético baseado em RNA eficaz (RNAi) torna-se uma técnica indispensável na pesquisa genética funcional da P. americana. O presente protocolo descreve as técnicas de operação RNAi em P. americana. O protocolo inclui (1) seleção do P. americana em estágios de desenvolvimento adequados, (2) preparação para a configuração da injeção, (3) injeção de dsRNA e (4) detecção de eficiência de knockdown genético. RNAi é uma poderosa ferramenta genética reversa em P. americana. A maioria dos tecidos P. americanas são sensíveis ao dsRNA extracelular. Sua simplicidade permite que os pesquisadores obtenham rapidamente fenótipos disfuncionais sob uma ou múltiplas injeções de dsRNA, permitindo que os pesquisadores usem melhor o P. americana para estudos de desenvolvimento e metamórficos.
Introduction
A interferência de RNA (RNAi), um mecanismo evolutivamente conservado, gradualmente se torna uma ferramenta essencial de reversão genética para inibir a expressão genética em muitos organismos1, uma vez que Andrew Fire e Craig Mello2 desenvolveram a estratégia de silêncio genético mediado por duplar (dsRNA). dsRNA é cortado em fragmentos de 21-23 nucleotídeos, pequenas RNAs interferentes (siRNAs), pela enzima Dicer em células para ativar a via RNAi. Em seguida, siRNAs são incorporadas ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que casa o mRNA alvo, causa decote mRNA e, finalmente, resulta na perda da função genética 3,4,5. Entre as espécies de insetos, muitos experimentos sistêmicos rnai foram relatados até agora em muitas ordens de insetos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
As baratas (Blattaria) são uma família essencial de insetos em estudos de desenvolvimento e metamórficos com seus ciclos de crescimento rápido, forte adaptabilidade ao meio ambiente e alta plasticidadede desenvolvimento 9. Antes de descobrir que a RNAi era compatível com baratas, pesquisas anteriores focavam apenas na prevenção e controle de baratas devido à escassez de técnicas de manipulação genética em baratas. A estrutura única da ootheca da barata tornou desafiador realizar o nocaute genético baseado em injeção de embriões com o sistema CRISPR-Cas9. Além disso, a maioria dos tecidos em baratas (como P. americana) apresenta robusta resposta sistêmica RNAi, permitindo a rápida geração de fenótipos disfuncionais injetando um ou mais dsRNAs 9,10,11. Essas características fizeram da RNAi uma técnica indispensável em pesquisa funcional genética em P. americana.
Embora tenha sido relatado o uso de RNAi em pesquisa genética funcional em P. americana , não foi relatada nenhuma descrição detalhada ou passo a passo. Este relatório fornece uma diretriz operacional passo a passo para rnai em P. americana, útil para o estudo da função genética em outras baratas. Além disso, este guia não se limita a Blattodea e pode ser aplicado a muitos outros insetos com pequenas modificações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório descreveu uma estratégia metodológica passo a passo da RNAi em P. americana; note-se que também pode ser aplicado a outras baratas (Blattella germanica, por exemplo) e muitos outros insetos com pequenas alterações. No entanto, a eficiência de silenciamento genético da RNAi nem sempre é alta o suficiente, com uma desvantagem óbvia em comparação com a estratégia de nocaute genético13. O seguinte efeito residual do nível genético pode interferir com os…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 32070500, 31620103917, 31330072, e 31572325 à C.R., Sh.L.), pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Guangdong (Grant No. 2019B090905003 e 2019A0102006), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (Grant No. 202102020110), pelo Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 para Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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