Pooled shRNA Library Screening for at identificere faktorer, der modulerer en lægemiddelresistensfænotype
Summary
RNA-interferens (RNAi) screening med høj gennemstrømning ved hjælp af en pulje af lentivirale shRNA’er kan være et værktøj til at detektere terapeutisk relevante syntetiske dødelige mål i maligniteter. Vi tilbyder en poolet shRNA-screeningsmetode til at undersøge de epigenetiske effektorer ved akut myeloid leukæmi (AML).
Abstract
Forståelse af klinisk relevante drivermekanismer for erhvervet kemoresistens er afgørende for at belyse måder at omgå resistens på og forbedre overlevelsen hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). En lille brøkdel af leukæmiske celler, der overlever kemoterapi, har en klar epigenetisk tilstand til at tolerere kemoterapeutisk fornærmelse. Yderligere eksponering for kemoterapi gør det muligt for disse lægemiddel persisterceller at opnå en fast epigenetisk tilstand, hvilket fører til ændret genekspression, hvilket resulterer i spredning af disse lægemiddelresistente populationer og til sidst tilbagefald eller ildfast sygdom. Derfor er det afgørende at identificere epigenetiske moduleringer, der nødvendiggør overlevelse af lægemiddelresistente leukæmiske celler. Vi beskriver en protokol til identifikation af epigenetiske modulatorer, der medierer resistens over for nukleosidanalog cytarabin (AraC) ved hjælp af poolet shRNA-biblioteksscreening i en erhvervet cytarabinresistent AML-cellelinje. Biblioteket består af 5.485 shRNA-konstruktioner rettet mod 407 humane epigenetiske faktorer, hvilket muliggør epigenetisk faktorscreening med høj gennemstrømning.
Introduction
Terapeutiske muligheder i akut myeloid leukæmi (AML) har været uændrede i næsten de sidste fem årtier, med cytarabin (AraC) og anthracycliner som hjørnestenen til behandling af sygdommen. En af udfordringerne for succesen med AML-terapi er leukæmiske stamcellers resistens over for kemoterapi, hvilket fører til sygdomstilbagefald 1,2. Epigenetisk regulering spiller en afgørende rolle i kræftpatogenese og lægemiddelresistens, og flere epigenetiske faktorer har vist sig som lovende terapeutiske mål 3,4,5. Epigenetiske reguleringsmekanismer påvirker spredning og overlevelse under kontinuerlig eksponering for kemoterapeutiske lægemidler. Undersøgelser af ikke-hæmatologiske maligniteter har rapporteret, at en lille brøkdel af celler, der overvinder lægemiddeleffekten, gennemgår forskellige epigenetikmodifikationer, hvilket resulterer i disse cellers overlevelse 6,7. Epigenetiske faktorers rolle i formidlende erhvervet resistens over for cytarabin i AML er imidlertid ikke blevet undersøgt.
Screening med høj kapacitet er en tilgang til lægemiddelopdagelse, der har fået global betydning over tid og er blevet en standardmetode i forskellige aspekter til at identificere potentielle mål i cellulære mekanismer, til vejprofilering og på molekylært niveau 8,9. Begrebet syntetisk dødelighed involverer interaktionen mellem to gener, hvor forstyrrelsen af begge gener alene er levedygtig, men af begge gener samtidig resulterer i tab af levedygtighed10. Udnyttelse af syntetisk dødelighed i kræftbehandling kan hjælpe med at identificere og mekanisk karakterisere robuste syntetiske dødelige genetiske interaktioner11. Vi har vedtaget en kombinatorisk tilgang til shRNA-screening med høj gennemstrømning med syntetisk dødelighed for at identificere de epigenetiske faktorer, der er ansvarlige for erhvervet cytarabinresistens i AML.
Akutte leukæmier drevet af kromosomtranslokation af det blandede slægts leukæmigen (MLL eller KMT2A) vides at være forbundet med dårlig overlevelse hos patienter. De resulterende kimære produkter af MLL-genomlejringer, dvs. MLL-fusionsproteiner (MLL-FP’er), kan omdanne hæmatopoietiske stamceller / stamceller (HSPC’er) til leukæmiske blaster med inddragelse af flere epigenetiske faktorer. Disse epigenetiske regulatorer udgør et kompliceret netværk, der dikterer vedligeholdelsen af leukæmiprogrammet og derfor kan danne potentielle terapeutiske mål. I denne sammenhæng brugte vi MV4-11-cellelinjen (der huser MLL-fusionsgenet MLL-AF4 med FLT3-ITD-mutationen; betegnet som MV4-11 P) til at udvikle den erhvervede cytarabinresistente cellelinje, betegnet som MV4-11 AraC R. Cellelinjen blev udsat for stigende doser cytarabin med intermitterende genopretning fra lægemiddelbehandlingen, kendt som en lægemiddelferie. Den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) blev vurderet ved in vitro-cytotoksicitetsassay.
Vi brugte det poolede epigenetiske shRNA-bibliotek (se tabel over materialer) drevet af hEF1a-promotoren med en pZIP lentiviral rygrad. Dette bibliotek består af shRNA’er rettet mod 407 epigenetiske faktorer. Hver faktor har 5-24 shRNA’er med i alt 5.485 shRNA’er, herunder fem ikke-målrettede kontrol-shRNA’er. Det modificerede “UltrmiR” miR-30 stillads er optimeret til effektiv primær shRNA-biogenese og ekspression12,13.
Omridset af dette eksperiment er illustreret i figur 1A. Den nuværende protokol fokuserer på RNAi-screening ved hjælp af den epigenetiske faktor shRNA-biblioteket i MV4-11 AraC R-cellelinjen (figur 1B), en suspensionscellelinje. Denne protokol kan bruges til at screene ethvert målrettet bibliotek i enhver lægemiddelresistent cellelinje efter eget valg. Det skal bemærkes, at transduktionsprotokollen vil være forskellig for klæbende celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-interferens (RNAi) anvendes i vid udstrækning til funktionelle genomiske undersøgelser, som omfatter siRNA- og shRNA-screening. Fordelen ved shRNA er, at de kan inkorporeres i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA, hvilket resulterer i stabil ekspression og dermed mere langvarig knockdown af mål-mRNA’et. En poolet shRNA-biblioteksscreening er robust og omkostningseffektiv sammenlignet med de konventionelle arrayed screens (siRNA). Det kan være besværligt at identificere væsentligheden af en bestemt klass…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse finansieres delvist af et Institut for Bioteknologi tilskud BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 til SRV; og Institut for Bioteknologi Indien BT/ COE / 34 / SP13432/2015 og Institut for Videnskab og Teknologi, Indien: EMR / 2017 / 003880 til P.B. RVS og P.B. understøttes af henholdsvis Wellcome DBT India Alliance IA / S / 17/ 1 / 503118 og IA / S / 15/1 / 501842. S.D. støttes af CSIR-UGC-stipendiet, og S.I. støttes af et ICMR-seniorforskningsstipendium. Vi takker Abhirup Bagchi, Sandya Rani og CSCR Flow Cytometry Core Facility-personalet for deres hjælp. Vi takker også MedGenome Inc. for at hjælpe med sekventering og dataanalyse med høj kapacitet.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
