הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות
Summary
בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).
Abstract
הבנת מנגנוני המניע הרלוונטיים מבחינה קלינית של עמידות נרכשת לכימותרפיה היא חיונית להבהרת דרכים לעקוף את העמידות ולשפר את ההישרדות בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). לחלק קטן מהתאים הלוקמיים ששורדים את הכימותרפיה יש מצב אפיגנטי מפויס לסבול עלבון כימותרפי. חשיפה נוספת לכימותרפיה מאפשרת לתאים אלה המתמידים בתרופות להגיע למצב אפיגנטי קבוע, מה שמוביל לביטוי גנים משתנה, וכתוצאה מכך להתרבותן של אוכלוסיות עמידות לתרופות אלה ובסופו של דבר למחלה חוזרת או עקשן. לכן, זיהוי אפנון אפיגנטי המחייב הישרדות של תאים לוקמיים עמידים לתרופות הוא קריטי. אנו מפרטים פרוטוקול לזיהוי מודולטורים אפיגנטיים המתווכים את ההתנגדות לציטרבין האנלוגי הנוקלאוזידי (AraC) באמצעות סינון ספריית shRNA משולבת בקו תאי AML עמיד לציטרבין שנרכשו. הספרייה מורכבת מ-5,485 מבנים של shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים אנושיים, מה שמאפשר סינון גורמים אפיגנטיים בתפוקה גבוהה.
Introduction
אפשרויות טיפוליות בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) נותרו ללא שינוי במשך כמעט חמשת העשורים האחרונים, כאשר ציטרבין (AraC) ואנתרציקלין הם אבן הפינה לטיפול במחלה. אחד האתגרים להצלחת הטיפול ב-AML הוא עמידותם של תאי גזע לוקמיים לכימותרפיה, מה שמוביל להישנות המחלה 1,2. ויסות אפיגנטי ממלא תפקיד חיוני בפתוגנזה של סרטן ובעמידות לתרופות, ומספר גורמים אפיגנטיים התגלו כמטרות טיפוליות מבטיחות 3,4,5. מנגנוני ויסות אפיגנטיים משפיעים על התפשטות והישרדות תחת חשיפה מתמשכת לתרופות כימותרפיות. מחקרים בממאירות שאינה המטולוגית דיווחו כי חלק קטן מהתאים המתגברים על השפעת התרופה עוברים שינויים אפיגנטיים שונים, וכתוצאה מכך הישרדותם של תאים אלה 6,7. עם זאת, תפקידם של גורמים אפיגנטיים בתיווך עמידות נרכשת לציטרבין ב-AML לא נחקר.
סינון בתפוקה גבוהה הוא גישה לגילוי תרופות שצברה חשיבות עולמית עם הזמן והפכה לשיטה סטנדרטית בהיבטים שונים לזיהוי מטרות פוטנציאליות במנגנונים תאיים, ליצירת פרופיל מסלולים וברמה המולקולרית 8,9. מושג הקטלניות הסינתטית כולל את האינטראקציה בין שני גנים שבהם ההפרעה של כל אחד מהגנים לבדה היא בת קיימא, אך של שני הגנים גורמת בו זמנית לאובדן הכדאיות10. ניצול קטלניות סינתטית בטיפול בסרטן יכול לסייע בזיהוי ואפיון מכניסטי של אינטראקציות גנטיות סינתטיות קטלניות חזקות11. אימצנו גישה קומבינטורית של בדיקת shRNA בתפוקה גבוהה עם קטלניות סינתטית כדי לזהות את הגורמים האפיגנטיים האחראים לעמידות ציטראבינית נרכשת ב-AML.
לוקמיה חריפה המונעת על ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית של גן הלוקמיה המעורבת (MLL או KMT2A) ידועה כקשורה להישרדות לקויה בחולים. התוצרים הכימריים המתקבלים של סידור מחדש של גנים מסוג MLL , כלומר חלבוני היתוך MLL (MLL-FPs), יכולים להפוך תאי גזע/אב המטופויאטיים (HSPCs) לפיצוצים לוקמיים עם מעורבות של גורמים אפיגנטיים מרובים. הרגולטורים האפיגנטיים הללו מהווים רשת מורכבת המכתיבה את תחזוקת תוכנית הלוקמיה, ולכן עלולים ליצור מטרות טיפוליות פוטנציאליות. בהקשר זה, השתמשנו בקו התאים MV4-11 (המכיל את גן ההיתוך MLL MLL-AF4 עם מוטציית FLT3-ITD; המכונה MV4-11 P) כדי לפתח את קו התאים העמיד לציטראבין שנרכש, המכונה MV4-11 AraC R. קו התאים נחשף למינונים הולכים וגדלים של ציטרבין עם החלמה לסירוגין מהטיפול התרופתי, הידוע כחופשת סמים. הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC50) הוערך על ידי בדיקת ציטוטוקסיות במבחנה .
השתמשנו בספריית ה-shRNA האפיגנטית המאוגנת (ראו טבלת חומרים) המונעת על ידי מקדם hEF1a עם עמוד שדרה pZIP lentiviral. ספריה זו כוללת shRNA המכוונים ל-407 גורמים אפיגנטיים. לכל גורם יש 5-24 shRNA, עם סך של 5,485 shRNA, כולל חמישה shRNA בקרה שאינם ממוקדים. פיגום ה-miR-30 “UltrmiR” שעבר שינוי עבר אופטימיזציה לביוגנזה של shRNA ראשוני יעיל ולביטוי12,13.
קווי המתאר של הניסוי הזה מתוארים באיור 1A. הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בסינון RNAi באמצעות ספריית shRNA של גורמים אפיגנטיים בקו התאים MV4-11 AraC R (איור 1B), קו תאי השעיה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן כל ספרייה ממוקדת בכל קו תאים עמיד לתרופות לפי בחירתו. יש לציין כי פרוטוקול ההתמרה יהיה שונה עבור תאים חסידיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרעות RNA (RNAi) נמצאות בשימוש נרחב למחקרי גנומיקה פונקציונליים, הכוללים בדיקות siRNA ו-shRNA. היתרון של shRNA הוא שהם יכולים להיות משולבים בווקטורים של פלסמידים ולשלב אותם בדנ”א הגנומי, וכתוצאה מכך ביטוי יציב, ולכן, פגיעה ממושכת יותר של ה-mRNA של המטרה. הקרנה משולבת של ספריית shRNA היא חזקה וחסכונית בהשוו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה ממומן בחלקו על ידי מענק המחלקה לביוטכנולוגיה BT/PR8742/AGR/36/773/2013 ל-SRV; והמחלקה לביוטכנולוגיה של הודו BT/COE/34/SP13432/2015 והמחלקה למדע וטכנולוגיה, הודו: EMR/2017/003880 עד P.B. RVS ו-P.B. נתמכים על ידי Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 ו-IA/S/15/1/501842, בהתאמה. S.D. נתמך על ידי מלגת CSIR-UGC, ו- S.I. נתמך על ידי מלגת מחקר בכירה של ICMR. אנו מודים לאבהירופ באגצ’י, לסנדיה ראני ולצוות מתקן הליבה של CSCR Flow Cytometry על עזרתם. אנו מודים גם ל- MedGenome Inc. על העזרה בריצוף בתפוקה גבוהה ובניתוח נתונים.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
