Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas
Summary
A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).
Abstract
Compreender mecanismos de condutores clinicamente relevantes da quimio-resistência adquirida é crucial para elucidar formas de contornar a resistência e melhorar a sobrevivência em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Uma pequena fração de células leucêmicas que sobrevivem à quimioterapia têm um estado epigenético equilibrado para tolerar insultos quimioterápicos. A exposição adicional à quimioterapia permite que essas células persistoras de medicamentos atinjam um estado epigenético fixo, o que leva à alteração da expressão genética, resultando na proliferação dessas populações resistentes a medicamentos e, eventualmente, recaídas ou doenças refratárias. Portanto, identificar modulações epigenéticas que necessitam da sobrevivência de células leucêmicas resistentes a medicamentos é fundamental. Detalhamos um protocolo para identificar moduladores epigenéticos que mediam a resistência à cytarabina analógica nucleosídea (AraC) usando a triagem da biblioteca shRNA agrupada em uma linha celular AML resistente à cytarabina adquirida. A biblioteca consiste em 5.485 construções de shRNA visando 407 fatores epigenéticos humanos, o que permite a triagem de fatores epigenéticos de alto rendimento.
Introduction
As opções terapêuticas na leucemia mielóide aguda (LMA) permaneceram inalteradas por quase cinco décadas, com a cytarabina (AraC) e as anthracycraclines como a pedra angular para o tratamento da doença. Um dos desafios para o sucesso da terapia LMA é a resistência das células-tronco leucêmicas à quimioterapia, levando à recaída da doença 1,2. A regulação epigenética desempenha um papel vital na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos, e vários fatores epigenéticos surgiram como alvos terapêuticos promissores 3,4,5. Os mecanismos regulatórios epigenéticos afetam a proliferação e a sobrevivência sob exposição contínua a drogas quimioterápicas. Estudos em malignidades não hematológicas relataram que uma pequena fração de células que superam o efeito da droga sofrem várias modificações epigenéticas, resultando na sobrevivência dessas células 6,7. No entanto, o papel dos fatores epigenéticos na mediação da resistência adquirida à cytarabina na LMA não foi explorado.
A triagem de alto rendimento é uma abordagem para a descoberta de drogas que ganhou importância global ao longo do tempo e tornou-se um método padrão em diferentes aspectos para identificar potenciais alvos em mecanismos celulares, para perfilamento de caminhos e no nível molecular 8,9. O conceito de letalidade sintética envolve a interação entre dois genes onde a perturbação de qualquer gene sozinho é viável, mas de ambos os genes simultaneamente resulta na perda de viabilidade10. Explorar a letalidade sintética no tratamento do câncer pode ajudar a identificar e caracterizar mecanicamente interações genéticas letais sintéticasrobustas 11. Adotamos uma abordagem combinatória de triagem de shRNA de alto rendimento com letalidade sintética para identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela aquisição da resistência à cytarabina na LMA.
Leucemias agudas impulsionadas pela translocação cromossômica do gene de leucemia de linhagem mista (MLL ou KMT2A) são conhecidas por estarem associadas à má sobrevivência em pacientes. Os produtos quiméricos resultantes dos rearranjos genéticos de MLL , ou seja, proteínas de fusão de MLL (MLL-FPs), podem transformar células hematopoiéticas de tronco/progenitor (HSPCs) em explosões leucêmicas com o envolvimento de múltiplos fatores epigenéticos. Esses reguladores epigenéticos constituem uma rede complicada que dita a manutenção do programa de leucemia e, portanto, poderia formar potenciais alvos terapêuticos. Neste contexto, utilizamos a linha celular MV4-11 (abrigando o gene de fusão MLL-AF4 com a mutação FLT3-ITD; denominada como MV4-11 P) para desenvolver a linha celular resistente à cytarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. A linha celular foi exposta ao aumento de doses de cytarabina com recuperação intermitente do tratamento medicamentoso, conhecido como feriado medicamentoso. A concentração inibitória semi-máxima (IC50) foi avaliada pelo ensaio de citoxicidade in vitro .
Utilizamos a biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabela de Materiais) impulsionada pelo promotor hEF1a com uma espinha dorsal lentiviral pZIP. Esta biblioteca compreende shRNAs visando 407 fatores epigenéticos. Cada fator tem 5-24 shRNAs, com um total de 5.485 shRNAs, incluindo cinco shRNAs de controle não direcionados. O andaime miR-30 modificado “UltrmiR” foi otimizado para biogênese e expressão primária eficiente12,13.
O esboço deste experimento é ilustrado na Figura 1A. O protocolo atual concentra-se na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha de células R MV4-11 (Figura 1B), uma linha celular de suspensão. Este protocolo pode ser usado para selecionar qualquer biblioteca direcionada em qualquer linha celular resistente a medicamentos de sua escolha. Deve-se notar que o protocolo de transdução será diferente para as células aderentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A interferência de RNA (RNAi) é amplamente utilizada para estudos de genômica funcional, que incluem a triagem de siRNA e shRNA. O benefício do shRNA é que eles podem ser incorporados em vetores plasmídeos e integrados ao DNA genômico, resultando em expressão estável e, portanto, mais longo knockdown do mRNA alvo. Uma triagem de biblioteca shRNA agrupada é robusta e econômica em comparação com as telas convencionais (siRNA). Identificar a essencialidade de uma classe específica de proteínas em uma tela de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é financiado em parte por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; e Departamento de Biotecnologia Índia BT/COE/34/SP13432/2015 e Departamento de Ciência e Tecnologia, Índia: O EMR/2017/003880 para P.B. RVS e P.B. são apoiados pela Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. A S.D. é apoiada pela bolsa CSIR-UGC, e a S.I. é apoiada por uma bolsa de pesquisa sênior do ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani e a equipe do CSCR Flow Cytometry Core Facility por sua ajuda. Agradecemos também à MedGenome Inc. por ajudar com o sequenciamento de alto rendimento e análise de dados.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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