マウス大腿骨首のカンチレバー曲げ
Summary
本議定書は、片持ち梁曲げセットアップにおけるマウス大腿骨頸部のための再現性のある試験プラットフォームの開発を記述している。カスタム3Dプリントガイドを使用して、大腿骨を最適なアライメントで一貫してしっかりと固定しました。
Abstract
大腿骨頸部の骨折は、骨粗鬆症を有する個体において一般的な発生である。疾患の状態と治療法を評価するために多くのマウスモデルが開発されており、生体力学的検査が主要な転帰尺度となっています。しかし、従来の生体力学的試験は、長骨の中間軸に適用されるねじりまたは曲げ試験に焦点を当てている。これは、典型的には、骨粗鬆症患者における高リスク骨折の部位ではない。したがって、骨粗鬆症患者が経験する骨折の種類をよりよく再現するために、片持ち梁曲げ荷重でマウス大腿骨の大腿骨頸部を試験する生体力学的試験プロトコルが開発された。生体力学的結果は、大腿骨頸部に対する曲げ荷重方向に大きく依存するため、3Dプリントガイドは、荷重方向に対して20°の角度で大腿骨シャフトを維持するために作成されました。新しいプロトコルは、アライメントのばらつき(21.6°±1.5°、COV = 7.1%、n = 20)を低減し、測定された生体力学的結果の再現性を向上させる(平均COV = 26.7%)ことにより、試験を合理化しました。信頼性の高い試料アライメントのために3Dプリントガイドを使用する新しいアプローチは、骨粗鬆症のマウス研究におけるサンプルサイズを最小限に抑えるはずの、試料ミスアライメントによる測定誤差を低減することにより、厳密さと再現性を向上させます。
Introduction
骨折リスクは、骨粗鬆症に関連する深刻な医学的懸念である。米国だけでも毎年150万件以上の脆弱性骨折が報告されており、主要な骨折タイプ1として股関節、特に大腿骨頸部に骨折が起こっています。女性の18%、男性の6%が一生のうちに大腿骨頚部骨折を経験すると推定され2、 骨折後1年の死亡率は20%を超えています1。したがって、大腿骨頸部の生体力学的試験を可能にするマウスモデルは、脆弱性骨折の研究に適している可能性がある。マウスモデルはまた、骨粗鬆症に潜在的に関与する翻訳可能な細胞および分子事象を解明するための強力なツールを提供する。これは、遺伝子レポーターの利用可能性、機能モデルの利得と喪失、および分子技術と試薬の広範なライブラリによるものです。マウスの骨の機械的検査は、疾患の病因を説明する可能性のある骨の健康状態、遺伝子型および表現型の変動を決定し、骨の質および骨折のリスクの転帰尺度に基づいて治療法を評価するために必要な転帰尺度を提供することができる3。
大腿骨頸部の解剖学的構造は、典型的には曲げ(曲げ)骨折につながるユニークな機械的負荷シナリオを作成する。大腿骨頭は、大腿骨の近位端にある寛骨臼ソケットに装填される。これにより、大腿骨頸部に片持ち梁曲げシナリオが作成され、大腿骨軸に遠位に取り付けられます4。これは、大腿骨中枢骨幹に対する従来の3点または4点曲げ試験とは異なります。これらの試験は有用であるが、骨折位置または負荷シナリオに関して、骨減少性および骨粗鬆症の個体において脆弱性骨折に典型的につながる負荷を再現しない。
マウスにおける脆弱性骨折リスクをよりよく評価するために、マウス大腿骨頸部の片持ち梁曲げ試験の再現性を改善することが求められた。理論的に予測されたように、大腿骨軸に対する大腿骨頭部への荷重角度は、転帰尺度5に大きく影響することが示されており5、それによって報告された転帰の信頼性および再現性に対する課題が生じている。サンプル調製中に大腿骨の適切かつ一貫した位置合わせを確実にするために、C57BL/6マウス大腿骨のμCTスキャンで行われた解剖学的測定に基づいてガイドを設計し、3Dプリントしました。ガイドは、大腿骨シャフトが垂直荷重方向から約20°に維持されるように、サンプルを一貫してポッティングするのに役立つように設計されています。この角度が選択されたのは、大腿骨シャフトに沿った最大曲げモーメントを最小限に抑えながら剛性を最大化し、大腿骨頸部骨折の可能性を高め、より一貫性のある再現性のある試験につながるためです5。ガイドは、サンプル間の解剖学的違いに対応するためにさまざまなサイズで3Dプリントされ、アクリル骨セメントでポッティングしながらサンプルを安定した位置に保持するために使用されました。剛性、最大力、降伏力、および最大エネルギーは、力-変位グラフから計算されました。この試験方法は、前述の生体力学的結果について一貫した結果を示した。練習と3Dプリントガイドの助けを借りて、ミスアライメントによる測定誤差を最小限に抑えることができ、信頼性の高い結果測定が得られます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウス大腿骨頸部に対する信頼性の高い片持ち梁曲げ試験の概要を示しています。大腿骨頸部で起こる自然な片持ち梁屈曲シナリオは、通常、標準的な3点および4点曲げ試験では表されません5。この試験方法は、骨脆弱性患者が経験する大腿骨頚部骨折のタイプをより良くかつより確実に複製する。このプロトコルを実行する際の主な焦点は、大腿骨シ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH P30AR069655およびR01AR070613(H. A. A.)によって支持された。
Materials
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. . Bone Mechanics Handbook. Second end. , (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J. Osteoporosis and its complications. Medical Clinics of North America. 98 (4), 817-831 (2014).
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. . Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
