Консольный изгиб мышиной шейки бедренной кости

Summary

Настоящий протокол описывает разработку воспроизводимой испытательной платформы для мышиных шейк бедренной кости в консольной изгибающей установке. Пользовательские 3D-печатные направляющие использовались для последовательной и жесткой фиксации бедренных костей в оптимальном выравнивании.

Abstract

Переломы шейки бедра являются распространенным явлением у лиц с остеопорозом. Многие мышиные модели были разработаны для оценки болезненных состояний и методов лечения, с биомеханическим тестированием в качестве основного показателя результата. Тем не менее, традиционные биомеханические испытания сосредоточены на испытаниях на кручение или изгиб, применяемых к среднему валу длинных костей. Это, как правило, не место переломов высокого риска у людей с остеопорозом. Поэтому был разработан протокол биомеханического тестирования, который проверяет шейки бедренных костей мышей в консольной изгибающей нагрузке, чтобы лучше воспроизвести типы переломов, испытываемых пациентами с остеопорозом. Поскольку биомеханические результаты сильно зависят от направления изгиба нагрузки относительно шейки бедра, были созданы 3D-печатные направляющие для поддержания бедренного вала под углом 20° относительно направления нагрузки. Новый протокол упростил тестирование за счет снижения вариабельности выравнивания (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) и улучшил воспроизводимость в измеренных биомеханических исходах (средний COV = 26,7%). Новый подход с использованием 3D-печатных направляющих для надежного выравнивания образцов повышает строгость и воспроизводимость за счет уменьшения погрешностей измерения из-за смещения образцов, что должно свести к минимуму размеры выборки в исследованиях остеопороза на мышах.

Introduction

Риск переломов является серьезной медицинской проблемой, связанной с остеопорозом. Более 1,5 миллиона переломов хрупкости регистрируются каждый год только в Соединенных Штатах, причем переломы происходят в бедре, особенно в шейке бедра, в качестве ведущего типа переломов ¹. По оценкам, 18% женщин и 6% мужчин испытают перелом шейки бедра в течение своей ^жизни2, а уровень смертности через 1 год после перелома превышает 20%¹. Поэтому мышиные модели, позволяющие проводить биомеханическое тестирование шейки бедренной кости, могут быть пригодны для изучения переломов хрупкости. Мышиные модели также предлагают мощные инструменты для выяснения транслируемых клеточных и молекулярных событий, потенциально связанных с остеопорозом. Это связано с наличием генетических репортеров, приобретением и потерей функциональных моделей и обширной библиотекой молекулярных методов и реагентов. Механическое тестирование костей мышей может обеспечить необходимые показатели исхода для определения здоровья костей, генотипических и фенотипических вариаций, которые могут объяснить этиологию заболевания, и оценить терапию на основе показателей результатов качества кости и риска ^{перелома3}.

Анатомия шейки бедра создает уникальные сценарии механической нагрузки, которые обычно приводят к изгибающим (изгибающим) переломам. Головка бедренной кости нагружается в вертлужной впадины на проксимальном конце бедренной кости. Это создает консольный сценарий изгиба на шейке бедренной кости, которая жестко прикреплена к бедренному валу ^{дистально4}. Это отличается от традиционных 3- или 4-точечных тестов на сгибание бедренной кости в середине диафиза. Хотя эти тесты полезны, они не воспроизводят нагрузку, которая обычно приводит к переломам хрупкости у остеопенических и остеопоротических людей с точки зрения местоположения перелома или сценария нагрузки.

Чтобы лучше оценить риск переломов хрупкости у мышей, было предпринято стремление улучшить воспроизводимость консольных тестов на сгибание мышиных шейк бедренной кости. Как теоретически предсказано, угол нагрузки на головку бедренной кости относительно бедренного вала, как было показано, значительно влияет на показатели ^{исхода5}, тем самым создавая проблему для надежности и воспроизводимости сообщаемых результатов. Для обеспечения правильного и последовательного выравнивания бедренных костей во время пробоподготовки были разработаны направляющие и напечатаны на 3D-принтере на основе анатомических измерений, сделанных на μCT-сканировании бедренных костей мышей C57BL/6. Направляющие были разработаны, чтобы помочь в последовательной заливке образцов таким образом, чтобы бедренный вал поддерживался на уровне ~ 20 ° от вертикального направления нагрузки. Этот угол был выбран потому, что он максимизирует жесткость при минимизации максимального изгибающего момента вдоль бедренного вала, что увеличивает вероятность переломов шейки бедра и приводит к более последовательному и воспроизводимому ^{тестированию5}. Направляющие были напечатаны на 3D-принтере различных размеров для размещения анатомических различий между образцами и использовались для удержания образцов в стабильном положении во время горшка в акриловом костном цементе. Жесткость, максимальная сила, предел текучести и максимальная энергия были рассчитаны из графиков силы-смещения. Этот метод тестирования показал последовательные результаты для вышеупомянутого биомеханического результата. С практикой и помощью 3D-печатного руководства ошибки измерения из-за перекоса могут быть сведены к минимуму, что приводит к надежным показателям результата.

Protocol

Исследования на животных были одобрены Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами и самками C57BL/6 в возрасте от 24 до 29 недель. Мышей содержали в стандартных условиях с пищей и водой ad libitum. После эвтаназии с помощью в?…

Representative Results

При горшке с помощью направляющей бедренные валы выравнивались на 21,6° ± 1,5°. Хотя это представляет собой отклонение <10% от предполагаемого угла 20°, коэффициенты вариации (COV) угла горшка во всех тестируемых образцах составили 7,6% и 6,5% для самцов и самок мышей, соответственно (n = 10 на группу)…

Discussion

Этот протокол описывает надежный консольный тест на сгибание мышиной шейки бедренной кости. Сценарий естественного консольного изгиба, который происходит на шейке бедра, обычно не представлен в стандартных 3- и 4-точечных тестах на ^изгиб5. Этот метод тестирования лучше и на…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.